骨髓间充质干细胞（mesechymal stem cell, MSCs）是存在于骨髓中的除造血干细胞以外的另一类具有“无限”增殖和多向分化潜能的干细胞。在一定的诱导条件下，这类细胞可定向分化为各胚层来源组织，成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌肉细胞和神经细胞等。临床上MSCs可望应用于组织工程、细胞工程、基因治疗、细胞因子替代治疗等领域。

一、骨髓间充质干细胞的分离与培养

目前常用的分离MSc的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液以除去不贴壁细胞，逐渐纯化细胞，获得了细胞形态趋于一致、胞体饱满、以梭形为主、增殖迅速的干细胞作为实验细胞，是一种经济简单和有效的分离和纯化方法。密度梯度离心法根据骨髓中细胞成分比重的不同，利用Percoll分层液提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSc表面抗原认识的深入，有研究者利用流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，获得大量骨髓间充质干细胞。

（一）全骨髓直接培养法

【材料】

1．组织来源18～45岁的健康人骨髓样本。

2．培养用试剂无钙镁PBS (CMF-PBS )

3．培养基配方和制备L-DMEM培养基含10% FBS,100lU/ml青霉素和l00lU/ml链霉素。

4．实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿，注射器。

【方法】

1．取材5 ml肝素化的骨髓标本加入10ml的L-DMEM培养基。

2．接种细胞以2x10⁶/ml细胞浓度接种于培养板，于37℃,5% C0₂饱和湿度的培养箱中培养。48小时首次换液，换液时用PBS洗涤两次，7～10天传第一代，以后2～3天传代。

【结果】

全骨髓直接培养法得到的贴壁细胞形态多样，细胞成分多样，48～72小时后细胞呈纺锤形、长梭形、多角形，细胞增殖迅速，原代培养约5天左右可达到80％～90％融合。传2代后细胞较纯，5～7天内达到80％～90％融合，骨髓间充质干细胞呈典型的涡旋样排列（图6-2)。

【注意事项】

1．全骨髓培养法分离的骨髓间充质干细胞，早期细胞成分混杂，传2代后细胞较纯，细胞形态均一。

2．全骨髓培养法分离的骨髓间充质干细胞，操作简单、快速，骨髓需要量相对少，对细胞活性的影响小。

（二）密度梯度离心培养法

【材料】

1．组织来源18～45岁的健康人群骨髓。

2．培养用试剂

（1）PBS

(2) Percoll分层液（密度为1.037g/ml)

(3) 0.25%胰蛋白酶/0.02% EDTA混合消化液。

3．培养基配方和制备L-DMEM培养基含10% FBS, l001U/ml青霉素、l001U/ml链霉素。

4．实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、注射器、巴斯德吸管等。

【方法】

1.取材5 ml肝素化的骨髓标本加入10ml的PBS混匀。

2．消化1500r/min离心10分钟，弃上清液。

3．分离细胞洗涤后的细胞以PBS制成4x107/ml的悬液，取5 ml叠加5m1 Percoll分离液（1.073 g/ml）上，1500r/min离心10分钟，取单个核细胞层，PBS洗涤两次，以1x10⁶/ml的密度接种于培养瓶中，加入L-DMEM培养基，置37℃,5% CO₂的饱和湿度的孵箱中，48小时换液，以后每3～4天换液。

【结果】

密度梯度离心法分离得到的贴壁细胞呈圆形，48～72小时后呈纺锤形、梭形、多角形，增殖迅速，原代培养约7天左右可达到80％～90％融合。传代细胞24小时内完全贴壁，3～5天内达到80％～90％融合。

【注意事项】

1．细心分离单个核细胞层，获得骨髓间充质干细胞。

2．与全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞相比，密度梯度离心法获得的细胞纯度高。