胰岛干细胞（islet stem cells）可由胚胎干细胞分化而来，同时胰腺导管细胞在适当的体外培养条件下可转变为具有多向分化潜能的胰岛干细胞，进而分化形成胰岛β细胞。另外，机体内的成体干细胞也可经过横向分化形成胰岛干细胞。

一、小鼠胚胎干细胞诱导分化为胰岛干细胞

胚胎干细胞能在体外诱导分化为胰岛干细胞，是近年来国内外糖尿病治疗的研究热点。目前较为常用的分步诱导法模拟体内胰腺的发育过程，利用不同生长因子和小分子相结合将入ESCs定向诱导分化为胰岛干细胞。分步诱导法分为二期：①特定内胚层诱导期；②胰岛干细胞的富集期。在体外将ES细胞进行诱导分化时，将ES细胞聚集形成胚胎体（embry-onic bodies, EBs )，以EBs方式进行诱导。

【材料】

1．组织来源小鼠胚胎干细胞系Rl。

2．培养用试剂

（1）无钙镁PBS (CMF-PBS )。

(2）消化液：0.25%胰酶和0.02% EDTA混合消化液。

3．培养基配方和制备

（1）ES培养液：高糖DMEM培养基含有15% FBS,O.1mmol/L非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巯基乙醇,1 mmol/L谷氨酰胺、lOng/ml白血病抑制因子、100U/mL青霉素和100 ug/mL链霉素。

(2) EBs培养液：高糖DMEM培养基含有15 % FBS, 0.1 mmol/L非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巯基乙醇,1 mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素。

(3) ESCs诱导胰岛干细胞培养液：即胰岛前体细胞增殖培养液，EBs培养液培养液内含1% N_²添加物、2% B27添加物、25ng/ml bFGF。

4．实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、解剖显微镜、玻璃平皿、200目尼龙网、50m1和15m1离心管、手术刀、显微剪、显微镊。

【方法】

1．取材小鼠胚胎干细胞系R1常规方法复苏。

2. ES的体外扩增培养及EBs的形成ES接种于铺有MEF饲养层细胞的培养皿上，于37℃，含5% CO₂培养箱内培养。采用悬浮培养法制备EBs。将处于对数生长期的保持未分化状态的ES用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化后，吹打成单细胞悬液，ES细胞按密度为1个l00mm培养皿中接种2x10⁶/ml ES细胞，使用EBs培养液培养。

3. EBs向胰岛干细胞的诱导

(1) nestin阳性细胞的富集：将培养至第4天的EBs移入铺有明胶的6孔培养板，密度为300个／孔，加入诱导培养液，于37℃，含5% C0₂培养箱内培养6天，隔日换液，免疫组化染色，收集nestin阳性细胞进行胰腺前体细胞诱导。

(2)胰腺前体细胞（pancreatic precursor cells, PPCs）的诱导：在培养板中加入0.25％胰酶和0.02% EDTA 37℃孵育3～5分钟，消化同时轻轻振荡培养板。用含10% FBS的DMEM培养液终止消化。将细胞移入15 ml离心管，静止2分钟，吸取细胞悬液，1200r/min离心8分钟。加入诱导培养液，细胞接种于铺有L一多聚鸟氨酸的培养板，于37℃,5% CO₂培养箱内培养6天，隔天换液。

【结果】

胰岛细胞呈多角形或圆形，聚集形成集落。2周后大部分细胞呈悬浮状聚集生长。

【注意事项】

nestin阳性细胞的富集是整个诱导过程的核心步骤，此过程的诱导效率影响到胰岛干细胞的收集效率。

二、人胰腺导管制备胰岛干细胞

胰腺导管干细胞是一类存在于胰腺组织，能自我更新，具有多分化潜能的发育早期细胞，在特定的条件下，可分化为胰岛细胞。体外分离、克隆人类胰腺导管干细胞，并定向诱导使其分化为功能性胰岛细胞继而移植治疗糖尿病，是解决胰岛供体短缺的有效途径。

【材料】

1．组织来源无菌取3～5月龄人胎儿胰腺。

2．培养用试剂

（1）无钙镁PBS (CMF-PBS )。

(2）消化液：0.1%N型胶原酶,0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液。

3．培养基配方和制备低糖DMEM,10% FBS ,100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。

4．实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、解剖显微镜、玻璃平皿、200目尼龙网、50m1和15 ml离心管、手术刀、显微剪、显微镊。

【方法】

1．取材用含有DMEM的培养液中，用眼科剪将胰腺充分剪碎。

2．消化0.1 % 1V型胶原酶消化10分钟，加入含10% FBS的培养液终止反应。

3．分离细胞将细胞悬液移入离心管中，1000r/min离心5分钟，弃上清液。用巴斯德吸管反复吹打组织碎块至完全散开，离心洗涤后吹打制成细胞悬液，经200目尼龙网过滤，制成单细胞悬液。

4．接种与培养细胞计数，以3x10⁶个／ml密度接种于培养瓶中，置37℃,5% C0₂饱和湿度培养箱培养。隔天换液。培养6天后，用0.25％胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液消化并进行传代培养，纯化上皮样细胞。

【结果】

原代上皮样胰腺干细胞呈克隆性生长，7～10天可形成单层细胞。胰蛋白酶消化传代后，上皮样胰腺干细胞逐渐被纯化，获得纯化的胰岛干细胞。

【注意事项】

应用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液消化并传代培养，可达到去除胰岛细胞、纯化上皮样细胞的目的。

三、模拟微重力培养胰岛细胞

旋转细胞培养系统（rotating cell culture system, RCCS）是具有代表性的一种微重力反应器，应用较为普遍。RCCS是一种水平旋转、充满液体的圆柱形悬浮培养容器，提供模拟微重力环境，具有高效、3D结构和独特的流体力学特征等优点。这种低剪切力、高效物质交换的条件可为多种细胞和组织块的生长和代谢提供良好的培养环境。

研究表明通过在模拟微重力环境下培养胰腺R细胞，最终制造出具有立体结构的类胰岛组织。这种立体组织与胰腺中由R细胞等构成的胰岛结构非常相似，且制造胰岛素的能力更强。将这一组织移植给糖尿病模型鼠后，小鼠的血糖值明显下降。

【材料】

1．组织来源无菌取3～5月龄人胎儿胰腺。

2．培养用试剂

（1）Hanks液。

(2）消化液：0.5g/L胶原酶V。

3．培养基配方和制备RPMl 1640培养基、10% FBS,l00U/ml青霉素和100ug/ml链霉素。

4．实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、解剖显微镜、玻璃平皿、200目尼龙网、50m1和15 ml离心管、手术刀、显微剪、显微镊。

【方法】

1．取材无菌手术取出胰腺，置于RPMI 1640的培养液中，眼科剪将胰腺充分剪碎。

2．消化0.5g/L胶原酶V,37℃消化30分钟，用含10％小牛血清的Hanks液终止消化。

3．分离细胞200目尼龙网过滤，离心去除上清液，用Ficoll不连续密度梯度离心法纯化胰岛细胞。将上述分离的胰岛沉淀物加入3ml的250g/L Ficoll 400，充分混匀，随后不连续地缓慢依次加入230g/L,200g/L,110g/L的Ficoll400, 2000r/min离心10分钟，吸取110～200g/L及200～230g/L界面上的细胞，Hanks液洗涤3遍。

4．接种与培养细胞计数，以3x10⁶/ml密度接种于培养瓶中，纯化的胰岛细胞置含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在旋转式生物反应器对胰岛进行模拟微重力（三维胰岛细胞）培养。

【结果】

分离后的胰岛细胞呈圆形或椭圆形，大小不等，形态完整。

【注意事项】

1. 4℃下快速将胰腺剪碎，确保分离胰岛细胞的活力及活性。

2．模拟微重力培养胰岛细胞法优于传统的二维胰岛细胞培养法。