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诱导性多潜能干细胞

发布时间:2017-03-09 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1404

2007年,研究人员将Oct3/4, Sox2,c-Myc和Klf4这4种转录因子引入小鼠胚胎或皮肤成纤维细胞,发现可诱导其发生转化,产生的细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等都与胚胎干细胞极为相似。这种细胞被称为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS细胞)。由于可取自成体细胞,因此ipS细胞的使用可避免胚胎干细胞面临的伦理及免疫排斥问题,具有广泛的临床应用前景。

一、诱导性多能干细胞(ilpS )的制备

首先将几个重要的多能性相关基因通过病毒及非病毒转染等方法导入供体细胞(如小鼠和人的皮肤成纤维细胞)中,基因导入一段时间后,通过药物抗性或形态学特征等对转染的细胞进行选择,最后,筛选出的ips细胞要经过一系列严格的鉴定,证明其分化多能性。

【材料】

1.组织来源孕12~15日龄鼠。

2.培养用试剂

(1)无钙镁PBS (CMF-PBS)。

(2)消化液:0.05%胰酶-0.53 mM EDTA混合消化液。

3.培养基配方和制备

(1)MEF细胞培养基:高糖DMEM含有15%FCS,1%非必需氨基酸(NEAA),100U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素

(2) WS细胞培养基:高糖DMEM含有15% FCS,1%非必需氨基酸(NEAA),1000IU/mlLIF O.1 mmol/L 2-巯基乙醇、1OOU/ml青霉素和100ug/ml链霉素

(3) Plat-E(反转录病毒转染小鼠皮肤成纤维细胞)培养基:高糖DMEM含有10% FCS,100U/ml青霉素和l00 ug/ml链霉素

4.实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、解剖显微镜、玻璃平皿、200目尼龙网、50m1和15 ml离心管、手术刀、显微剪、显微镊、明胶包被的l00mm培养皿、明胶包被的24孔培养板。

【方法】

(1) MEF细胞的制备:妊娠12~15日龄的孕鼠,无菌条件取出胚胎,剥离羊膜,去除头、四肢和内脏,PBS冲洗,眼科剪剪碎,加入0.05%胰酶0.53mM EDTA混合消化液,于37℃水浴中消化5分钟,轻轻吹散细胞,加入含血清培养基终止消化。1200r/min离心5分钟,取沉淀,用MEF细胞培养液重悬细胞,细胞以8x105个/ml密度接种至明胶包被的l00mm培养皿,置37℃,5% CO2饱和湿度培养箱培养,传至第3代(P3)待用。

(2)病毒包装及MEF的感染:第1天,以每个l00mm培养皿8x106个接种Plat-E细胞。第2天下午,Plat-E细胞达到80%~90%融合,加入质粒Oct3/4,Sox2,c-Myc和Klf4。第3天上午,细胞转染后换液。第3天下午,接种P3代MEF细胞至六孔板,密度40000个/孔。第4天下午,分别收集病毒,过滤后加入至准备好的MEF细胞中,Plat-E培养加入Plat-E(小鼠反转录病毒)培养基。第5天下午,再次收集病毒,加入到MEF中。感染过夜后换为MEF培养液。

(3)转染后细胞筛选:第9天,挑选呈克隆样生长的细胞团,转移至预先铺有饲养层细胞的24孔培养板中,每孔移入6个克隆。37℃,5% C02饱和湿度培养箱培养。第13天时进行ALP染色。

【结果】

MEF细胞病毒感染第4天,可见细胞形态发生变化,由长梭形变为多边形,感染第9天,可见MEF细胞呈明显的ES克隆样生长,克隆呈圆形或椭圆形,边界清晰。克隆内细胞排列紧密,细胞体积小,核大,核质比高。感染第13天,ALP染色阳性。

【注意事项】

1.不同代次的饲养层细胞对ips细胞的维持能力不同,饲养层细胞传代次数越多,其对ips细胞的维持能力则越低。

2.细胞接种密度影响ips细胞生长,细胞密度高导致ips细胞堆积生长,克隆中部细胞容易营养缺乏而死亡。密度低导致ips细胞分化,一般T25的培养瓶种植(5~8)x105细胞为宜。

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