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常用肿瘤细胞株的培养

发布时间:2017-03-10 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1438

常用肿瘤细胞株的培养是细胞实验室的日常工作之一,常用的肿瘤细胞株很多,各实验室所使用和保存的细胞株种类各异,培养的方法和习惯也不尽相同。本节介绍了五种常用的肿瘤细胞株的培养和复苏、冻存的方法。

一、乳腺癌细胞株的培养

乳腺癌细胞系的种类很多,而且功能各异,下面介绍几种常用的乳腺癌细胞系的培养的方法。

(一)MCF一细胞株的培养

MCF-7是一种易于培养的人乳腺癌细胞,来源于乳腺腺癌组织,贴壁生长,形态不规则。一般培养基采用DMEM,含10%的胎牛血清。贴壁生长后,2~3天即可传代。

【材料】

1.冻存的MCF-7细胞株。

2.培养基(DMEM)含10%胎牛血清、含EDTA终浓度为0.25%的胰蛋白酶,75%乙醇

3.培养瓶、无菌的玻璃吸管或独立包装的塑料吸管、离心管。

【方法】

1.培养细胞的换液

(1)准备好超净工作台,将试剂及材料用75%乙醇杀菌后置于超净台,开始实验。

(2)从孵箱中取出培养瓶首先要仔细观察培养基有无污染或衰退迹象。

(3)观察培养.基的pH和细胞密度及浓度,如培养基从红色变成橙色,或变成黄色,说明培养基的pH已变酸,需要更换培养基;如培养基从红变为紫色,说明培养基的pH已变碱,可能细胞已死亡,需拣出丢弃。

(4)将细胞培养瓶置于无菌工作区域,无菌操作打开培养瓶瓶盖,倒掉培养液。

(5)用PBS反复冲洗细胞2~3遍,细胞培养条件要求苛刻的,可用细胞培养液冲洗细胞。

(6)加入预热的培养基,倒置显微镜下观察,放入培养箱中培养。

2.细胞的传代

(1)准备超净工作台,将试剂及材料用75%乙醇杀菌后置于超净台,开始实验。

(2)仔细检查培养基DMEM有无污染或衰退迹象。

(3)在镜下观察MCF-7细胞是否需要传代(主要看细胞密度是否长至彼此汇合,铺满培养瓶即可传代),若需要传代,进行如下操作。

(4)将MCF-7细胞置于超净台无菌工作区中,弃去原培养基。

(5)加入无血清培养液并轻轻晃动培养瓶,用培养液清洗细胞,然后弃去清洗液。这一步的目的在于去除残留的血清,因为血清可抑制胰酶的作用。

(6)加入含EDTA终浓度为0.25%的胰蛋白酶进行消化,为避免冲散细胞,沿培养瓶细胞面的对侧加入1 ml胰蛋白酶,(25 ml培养瓶),将培养瓶倒转过来并平放,以确保胰酶完全覆盖细胞层。静置15~30秒,弃去大部分胰蛋白酶,只保留少量的胰蛋白酶。

(7)平置培养瓶孵育,待细胞缩起变圆,倾斜培养瓶,单层细胞就会从培养瓶脱落,一般需要3~5分钟。

(8)加入新鲜培养液2ml,用吸管反复吹打细胞面以分散细胞成单细胞悬液。最后用吸管上下吹吸细胞数次,混匀细胞,注意不要产生气泡。

(9)将细胞悬液吸入15 ml离心管中,1000r/min离心5分钟,在离心过程中可在新的培养瓶中加入培养液4ml,

(10)待离心结束后细胞沉入管底,然后去掉上清液,加入2ml培养液重悬细胞,每个培养瓶中加入 1 ml细胞悬液,将培养瓶盖上盖后左右轻晃几下使细胞均匀分布,放入培养箱中培养。

3.细胞的冻存及复苏请参考本章的肿瘤细胞的冻存及复苏部分。

【注意事项】

1. MCF一生长较快,如2~3天不及时传代可出现整瓶细胞浮起,导致细胞死亡。

2.胰蛋白酶消化时间不宜过长,另一方面也不要在细胞消化好之前强制把细胞吹打下来,这样将导致细胞成片脱落。

3.用玻璃吸管吹打时,吹打的力量不要过大,这样会使细胞受到剪切力的机械损伤。

4.培养基在加入培养瓶之前应在37℃预热一段时间,培养瓶在室温中放置的时间应尽可能的短。

(二)MDA-MB-231细胞株的培养

MDA-MB-231是一种人乳腺癌细胞,来自于患有转移乳腺腺癌51岁女患者的胸腔积液,贴壁生长,大部分呈梭形。培养基用DMEM或RPMI 1640均可,添加10%~15%的胎牛血清,培养方法与MCF一相似,具体培养步骤参考MCF-7细胞株的方法。MDA-MB-231细胞株贴壁生长后,2~3天传代一次最适宜。传代间隔时间不宜过长,否则细胞的生长速度会下降,继续培养困难。

(三)MDA-MB-435细胞株的培养

MDA-MB-435也是人乳腺导管癌细胞,倍增时间大约24小时,具有高成瘤率和高转移性,这种细胞比较容易培养,过程和MCF-7相似,具体培养步骤参考MCF-7细胞株的方法。特殊之处在于,该细胞生长的速度较快,一般需要2天传代一次。

二、肝癌细胞株的培养

肝癌细胞株的复苏,传代,冻存和一般的癌细胞相似。但人肝癌HepG2细胞的培养有一些特殊性。具体如下:

1. HepG2细胞的培养需要胎牛血清的浓度要比一般肿瘤细胞高一些,一般为含15%的胎牛血清的DMEM,

2.细胞消化时所需要的胰蛋白酶浓度比一般的肿瘤细胞所需要的浓度要低一些,0.02% EDTA和0.15%胰蛋白酶大约以7:3的体积比混合后消化效果最好。

3.细胞复苏时开始先将冻存管放入40℃水浴中慢摇使其溶解,溶解后再迅速放入37℃水浴中至恒温,然后再继续一般肿瘤细胞所需的步骤。

三、肺癌细胞株的培养

实验室常用的肺癌细胞株A549细胞株,是人肺癌细胞,属于传代细胞系,可稳定的传代培养。一般用胰蛋白酶消化后,加入培养液稀释,以1:2或1:3传代培养都可行。

【材料】

1.冻存的A549细胞株。

2. PBS、含EDTA的胰蛋白酶、RPMI 1640培养基含10%的胎牛血清、75%乙醇

3.玻璃吸管、培养瓶、冻存管。

【方法】

1.细胞的复苏与培养

(1)准备37℃水浴,从液氮罐中取出A549细胞株的冻存管,放于37℃水浴箱中,用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。

(2)将冻存管放入离心机,1 000r/min,离心5分钟。

(3)在无菌超净台中用75%乙醇擦拭冻存管,然后用止血钳打开冻存管,注意动作要轻巧,不要让细胞沉淀上浮混浊。

(4)吸去上清液,加入预热的培养基1 ml重悬细胞,转移至培养瓶中。

(5)先补充4ml培养液到培养瓶中,经倒置显微镜下观察后,调整合适的密度分装培养瓶,放入37℃,5% C02培养箱中培养。

2.换液

(1) 24小时后更换新的培养液。无菌操作打开培养瓶瓶盖,倒掉培养液。

(2)用PBS反复冲洗细胞2~3遍。加入预热的培养基,倒置显微镜下观察,放入培养箱中培养。培养2~3天后,待细胞长满瓶底可以传代培养。

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