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PCR结合寡核苷酸探针杂交方法

发布时间:2017-03-11 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1017

目前已发现的大量癌基因中,ras基因研究得比较细致。ras基因的命名来自大鼠肉瘤(rat sarcoma)的字首,它于1964年首次从大鼠肉瘤的反转录病毒中分离出来,ras基因家族由3个密切相关的基因组成,即H-ras, K-ras, N-ras。基因在密码子12,13和61发生点突变都能使、癌基因活化产生ras癌基因,从而获得转化潜能。下面以ras基因为例,介绍PCR结合寡核苷酸探针杂交检测方法。

寡核苷酸探针杂交实验是一种能够直接检测出高分子量DNA中癌基因点突变的方法,操作简便,但灵敏度较低,用于分离DNA的样品细胞中,肿瘤细胞不能少于25%。PCR方法可选择性地扩增ras基因百万倍,大大提高了实验灵敏度,简化了操作过程。PCR结合寡核苷酸探针杂交,可同时检测大量的病历,灵敏度为5%~10%,使快速、灵敏地大规模检测各种类型肿瘤的ras癌基因点突变情况成为可能。

PCR结合寡核苷酸探针检测、基因点突变实验步骤可分为两步:首先进行PCR反应,使包含ras基因12,13,61位密码子的基因片段放大上百万拷贝;最后用检测ras基因第12,13和61碱基突变的寡核苷酸探针与扩增片段杂交,经严格控制条件的洗膜后放射自显影,检测点突变发生的类型及部位。

【材料】

1. DNA提取材料及PCR反应材料同上文中基本方法10

2.寡核苷酸探针杂交材料10x Kinase buffer, γ32 P-ATP (lOu Bq/ul比活3000Bq/mmol),T4 Polynucleotide Kinase、双蒸水、2xSSC,0.1% SDS。

【方法】

1. DNA提取 同上文中基本方法1。

2. PCR反应 用50ul反应体系

lOxPCR缓冲液     5u1

dNTP     0.2 mmol/L

引物      上下游引物各25 pmol

基因组DNA      0.5 ug

BSA(100x)     0.5 ul(可不加)

DMSO     5 ul(可不加)

加水至49 u1,经97℃ 5分钟,加入Taq DNA聚合酶1u1(2U)

94℃      30s

55℃      30s

72℃      30s

循环30次后,72℃延伸5分钟。取5ul在2%琼脂糖凝胶上检测扩增结果。置于-20℃保存。

3.寡核苷酸探针杂交

(1)根据样品数量的多寡取合适大小的尼龙膜,小心夹在点样器中。

(2)碱变性:10u1 PCR产物加上变性液(4mol/L Na0H,250mmo1/L EDTA-Na2)10ul,加水至100ul,作用5分钟。

(3)开动真空泵,取50ul变性PCR产物加入点样孔,边抽气边点样,样品上完后,以100ul2xSSC冲洗点样孔。

(4)取出尼龙膜,80℃烘烤2小时,使DNA固定在膜上。

(5)根据膜的大小配制预杂交液(含5xDenhardt's ,6xSSC,7% SDS和变性鲑鱼精子DNA 100ug/ml)。将膜与预杂交液封入塑料口袋,56℃预杂交2h。

(6)寡核苷酸探针的标记:取50~100ng,合成的寡核苷酸探针,加10 x Kinase buffer 2ul、γ32-P-ATP 2~5ul(lOuBq/u1比活3000Bq/mmol) T4 Polynucleotide Kinase 5~10U加双蒸水至20ul,37℃保温90分钟,70℃灭活5分钟,可直接用于杂交。吸去1/3预杂交液,加入标记好探针,封口后56℃杂交4~20小时。

(7)洗膜,取出杂交膜用2xSSC,0.1% SDS,58℃洗涤20小时,边洗边用探测器探测本底计数,以防杂交信号全部丢失或出现假阳性。

(8)洗净之杂交膜灯下干燥后,暗室包X线片,根据膜上杂交信号的强弱,放射自显影12~48小时。

[注意事项]

1.为提高成功率,应注意基因组DNA的质量,如果因模板的原因未出现PCR扩增区带,可取10 ug基因组DNA经稀释后100℃煮沸5~10分钟,然后过Sephadex G-50或G-75柱纯化,可获得满意扩增效果。

2.可以选用混合探针以减少使用不同探针杂交的次数。

3.本方法虽然具有快速、灵敏度高及检测量大等优点,但本方法只能检测已知的突变信息而不能发现新的突变类型。

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