与基因修饰的肿瘤细胞疫苗（GMTV）相比，使用体外抗原致敏的树突状细胞（dendriticcell,DC)疫苗则相当简便，且具有以下两个优点：①直接激活幼稚T细胞、CD4⁺ Th细胞和CDS⁺ CTL细胞；②现有的基因转移技术不能有效地转染人原代肿瘤细胞，因而较难获得足够量的GMTV细胞，而且多数人类肿瘤细胞不能体外培养；DC疫苗就不存在这些问题，因为现已建立DC体外大量扩增的方法并发现Flt3L可大量扩增DC，而且DC是机体内功能最强的抗原呈递细胞（APC)，也是唯一能够激活初始免疫应答的APC，在对肿瘤产生主动免疫上起着重要的作用：它摄取、加工肿瘤抗原，通过主要组织相容性复合物（MHC）-Ⅱ提呈，进而激活初始T细胞，使机体对肿瘤产生主动免疫。因此，DC瘤苗的制备与应用成为肿瘤免疫治疗的研究热点。

【材料】

1．标本及细胞正常人富含淋巴细胞抗凝血液，MCF-7乳腺癌细胞系，HT-29结肠癌细胞系，HeLa宫颈癌细胞系。

2．试剂淋巴细胞分离液，RPMI 1640，胎牛血清（FBS)，重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF)、重组人白介素-2(rhIL-2)、重组人白介素-4(rhIL-4)、重组人肿瘤坏死因子a(rhTNF-a)等。

3．主要设备流式细胞仪，酶标仪。

【方法】

1. DC的体外诱导和培养取正常人富含淋巴细胞抗凝血，用淋巴细胞分离液经室温下2000r/min离心15分钟，取界面细胞，用PBS重悬细胞，再以室温下2000r/min离心15分钟，洗涤2次后用含10% FBS的RPMI 1640重悬，调整细胞浓度至3x10⁶/ml。以每孔2mL加入6孔培养板，置37℃,5% C0₂孵箱2小时后用预热的RPMI 1640缓慢冲洗，并收集非黏附细胞于培养瓶。将6孔培养板中的黏附细胞以每孔2ml 10% FBS的RPMI 1640中培养，同时平行设3个组：①阴性对照组：不添加细胞因子的DC;②阳性对照组：细胞因子诱导的成熟DC;③实验组：细胞因子诱导并经肿瘤抗原冲击的成熟DC。三组均在37℃,5% C0₂孵箱中培养，其中后两组在培养液中添加GM-CSF(100ng/ml),IL-4(1000U/ml),4天后半量换液1次。阳性对照组第7天加入TNF-a(20ng/ml）作用24小时。

2．肿瘤细胞培养及制备肿瘤抗原乳腺癌细胞MCF-7常规培养，用无血清RPMI 1640以10⁵/ml收集细胞，经反复冻融5次后，室温下 500r/min，离心10分钟取上清液并测定其OD_280nm值。借助蛋白标准曲线OD_280nm值来确定肿瘤抗原的蛋白含量，-80℃备用。

3．体外肿瘤抗原冲击DC阳性实验组DC在培养第6天时，以2x10⁵个DC加入100 ug肿瘤抗原的比例加入MCF-7肿瘤抗原至培养上清液中，作用24小时后再加入TNF-a(20ng/ml)。第8天结束体外肿瘤抗原冲击DC的培养。

4. DC刺激T淋巴细胞将（1)中的非黏附DC细胞调整细胞浓度为2x10⁶/ml，培养于含IL-2500U/ml,10% FBS,2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的RPMI1640培养液中培养，8天后获取T淋巴细胞，再将肿瘤抗原冲击的成熟DC与T淋巴细胞按1:5的比例混合培养5天并共同作为效应细胞。

5. MTT检测肿瘤杀伤实验靶细胞MCF-7细胞以2x10⁵/ml的浓度100ul接种在96孔培养板中，设3个复孔的实验孔和靶细胞对照孔。按靶细胞：效应细胞1:10和1:20的比例共同孵育20小时，各孔内加入10 ul MTT (5mg/ml）作用4小时，2000r/min，室温下离心5分钟弃上清液，各孔加100ul DMSO，振荡混匀3～5分钟，测定OD_570nm。同时将HeLa和HT-29以同样的接种浓度作为非特异对照组。

【结果】

利用检测活细胞代谢水平的MTT比色法来确定T细胞对肿瘤细胞MCF-7的杀伤活性。在靶效比1:10和1:20情况下，未经DC激活的T细胞杀伤活性明显低于递呈肿瘤抗原成熟DC激活的T细胞杀伤活性。同时它的杀伤率也明显高于HeLa和HT-29非特异组。