北京普天同创生物科技有限公司
免疫细胞数量的变化,能够反映机体的免疫功能状态,有助于研究某种疾病的发病机制,为疾病的诊断和治疗提供依据。免疫细胞在各自正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中,其细胞膜表面均表达可供鉴别的特殊结构,即表面标志。其中CD分子常作为各类免疫细胞的表面标志用于免疫细胞的鉴定和分离,以及用于检测免疫细胞数量。
一、微量细胞毒试验检测各类免疫细胞的数量
【原理】
微量细胞毒试验(microcytotoxicity assay)是指抗体加补体的细胞毒试验,以淋巴细胞为例,在补体存在的情况下,针对淋巴细胞CD分子的McAb与相应的CD分子结合,则淋巴细胞就会受损或致死而被锥虫蓝染色,计数蓝染细胞从而得知T细胞亚群比例。该方法简便易行,准确性较高。
【材料】
1.外周血单个核细胞。
2.试剂2%锥虫蓝;新鲜兔补体。
3.抗CD3,CD4,CD8的单克隆抗体(McAb)。
【方法】
1.调整PBMC细胞浓度至2x106/ml,加入24孔细胞培养板中,每孔10ul,每份标本做3个复孔。
2.分别加入抗CD3,CD4,CD8的McAb每孔10 u1,同时设阴性对照。振荡混匀5秒,湿盒中37℃孵育30分钟。
3.加入新鲜兔补体,每孔40ul,振荡混匀5秒,放37℃湿盒内孵育60分钟。
4.加入2%锥虫蓝,每孔10ul,室温10分钟。
【结果】
显微镜下用细胞计数板计数死亡细胞,计算死亡细胞百分率。
【注意事项】
1.兔补体宜新鲜,活性高,最好将20只以上的兔血清混合后采集补体,小量分装,-20℃低温保存。
2.淋巴细胞宜新鲜,以免活力降低影响结果。
【注意事项】
1.兔补体宜新鲜,活性高,最好将20只以上的兔血清混合后采集补体,小量分装,-20℃低温保存。
2.淋巴细胞宜新鲜,以免活力降低影响结果。
二、免疫荧光染色技术检测各类免疫细胞的数量
【原理】
用荧光素标记抗人免疫细胞的单克隆抗体(McAb)直接与人免疫细胞反应;或用标记有荧光素的羊(或兔)抗鼠IgG作为第二抗体,再借助McAb的介导与人免疫细胞结合。在荧光显微镜下,结合有荧光素标记抗体的细胞在黑暗背景下发出荧光,计数发出荧光的细胞,从而确定各种免疫细胞的百分率。
【材料】
1.肝素抗凝外周血(肝素钠溶液:浓度为125~250U/ml)。
2. Hanks液和RPMI 1640细胞培养液。
3.抗CD3,CD4,CD8的McAb。
4. FITC-兔抗鼠IgG。
【方法】
1.取肝素抗凝外周血2~5ml,常规方法分离单个核细胞,调整细胞浓度至1.5x106/ml。
2.将单个核细胞悬液分别加入24孔细胞培养板内,每孔100ul,每份标本加3个复孔。水平1000r/min离心1分钟,弃上清液。
3.在1~3孔内分别加入抗CD3,CD4,CD8的McAb各20 ul,第4孔加入1640细胞培养液作为阴性空白对照。
4.将细胞培养板置振荡器上振荡5秒,使淋巴细胞与McAb充分混匀。放入有盖湿盒内,置4℃冰箱中放置45分钟。
5.取出后每孔加入Hanks液200 ul,振荡5秒,1000r/min离心1分钟。弃上清液,振荡5秒,加Hanks液200 u1,重复洗涤3次。
6.分别加入兔抗鼠IgG荧光抗体各10ul,振荡5秒,放入湿盒内4℃冰箱放置45分钟后,Hanks洗涤3次。
7.弃上清液,加入20%甘油缓冲液50~100ul振荡混匀后,用微量吸液器分别吸取细胞悬液滴至载玻片上,覆以盖玻片。
【结果】
在荧光显微镜下用高倍镜观察,分别计数200个淋巴细胞,记录荧光阳性细胞数(细胞膜上呈现明亮点状或帽状黄绿色荧光的细胞),然后分别计算出各兔种细胞的百分率。
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