流式细胞术是一种高速度、高灵敏度、高精度和高分辨率的自动分析细胞的高新技术。主要用于定量分析单细胞表面、细胞内抗原和对分子水平的核酸含量的测定。

【材料】

1. FIX（或PE）标记的抗CD的McAb及正常小鼠IgG。

2.细胞洗液含2% BSA,O.1% NaN₃的PBS。

3．固定液25％戊二醛3.2ml，葡萄糖2g加无BSA的细胞洗液至100m1。

4．流式细胞仪。

【方法】

1．分别于各实验管中加入106常规分离的外周血单个核细胞，1500r/min离心3分钟，弃上清液。

2．于每孔中加入荧光素标记的抗CD的McAb 20ml,混匀。

3. 4℃孵育60分钟，加入细胞洗液，1500r/min离心3分钟，反复洗涤3次；

4．用细胞洗液恢复体积至0.5ml，加入固定液20ml，混匀。

【结果】

用流式细胞仪检测。

免疫酶染色技术（ABC法）检测各类免疫细胞的数量

【原理】

免疫酶染色技术是指用如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等标记已知抗体（或抗原），然后与组织细胞在一定条件下反应，如果组织细胞中有相应抗原或抗体存在，抗原抗体就相互结合形成复合物，其中的酶分子遇到底物时，能催化底物产生颜色反应，从而可识别出标本中对应的抗原或抗体。该方法敏感性高，标本可长期保存，使用一般光学显微镜即可观察。在此介绍的ABC法是将亲和素与酶标生物素反应形成复合物（avidin-biotin-peroxidase com-plex, ABC)，再与生物素化的第二抗体反应，借助与T细胞反应的抗入T细胞亚群的McAb（第一抗体）介导和酶催化底物的作用，从而使阳性组织或细胞着色。

【材料】

1．缓冲甲醛-丙酮固定液（pH 6.6);1% H₂0₂-甲醇溶液。

2. ABC检测试剂盒 其中A试剂为亲和素，B试剂为辣根过氧化物酶结合的生物素。

3．生物素结合的抗鼠IgG抗体。

4．试剂二氨基联苯胺（DAB);0.5％硫酸铜：0.15mol/L NaOH溶液；苏木紫溶液。

5．正常马血清。

6. pH 7.4 PBS缓冲液；替代水：NaHC03 8g，无水硫酸镁40g，加自来水4L溶解。

7．脱水液70%,95%,100％乙醇。

【方法】

1．调整PBMC浓度至1x10⁶/ml；取100ul 500r/min离心5分钟，制片；用缓冲甲醛-丙酮液4℃固定30秒，取出用PBS漂洗后再浸于PBS中。

2．每张玻片上加100ul用PBS配制的2％马血清，在湿盒中孵育20分钟，浸于PBS中。

3．将抗CD3,CD4和CD8 McAb（一抗）100ul分别加在玻片细胞层上，并设阴性对照。置湿盒中37℃温育45分钟，然后用PBS浸洗2次，每次5分钟。

4．用含2％马血清的PBS稀释生物素结合的抗鼠IgG抗体（二抗），取100ul加在玻片细胞层上，置湿盒37℃温育30分钟，以PBS浸洗2次，每次5分钟。

5．所有标本浸入1% H₂0₂-甲醇溶液中30分钟，用PBS浸洗2次，每次5分钟。

6. ABC染色 取A.B试剂等量混合，在每张玻片的细胞单层上加100ul ABC试剂，置湿盒中孵育30分钟，然后用PBS浸洗2次，每次5分钟。

7．底物显色用1% H₂0₂ PBS配制0.05% DAB溶液，立即加在玻片单层细胞上，作用20分钟，然后用蒸馏水浸洗2次，每次2分钟。

8．用0.5％硫酸铜0.15mo1/L NaOH溶液浸洗玻片5分钟，再用蒸馏水浸洗5分钟。

9．用苏木紫溶液复染1分钟。用蒸馏水洗去多余的染液后，再用替代水浸洗3分钟。

10．用蒸馏水冲洗。依次用70%,95%,100％乙醇脱水各1分钟，再浸入二甲苯内1分钟，然后用盖玻片封片后镜检。

【结果】

油镜下观察细胞，胞质呈棕黄色，胞核呈蓝色者为阳性细胞；胞质和胞核均呈蓝色者为阴性细胞。计数200个细胞，计算出阳性细胞百分率。

【注意事项】

1．制片时玻片上的细胞不能过多，否则易造成非特异性背景着色；细胞数也不能过少，否则计数困难，影响结果。

2．浸洗步骤要严格执行，否则影响结果。