NK细胞是一种异质性、多功能的细胞群，具有抗肿瘤、抗感染和免疫调节功能并参与移植排斥反应和某些自身免疫疾病的发生。因而通过制备NK细胞克隆来开展对其功能的研究受到人们的高度重视。

（一）人NK细胞克隆的制备

NK细胞克隆来源于NK细胞，该细胞的分离方法参见第一节。这些NK细胞与经γ射线照射的饲养细胞孵育而获得的NK细胞克隆。

【材料】

1．植物血凝素（PHA)母液为100mg/L。

2．重组IL-2(rlL-2)母液为1x10⁸U/L，分装小瓶（0.5 ml/瓶），置-20℃长期保存，或置4℃短期存放。应避免反复冻融，IL-2不能用滤器过滤除菌处理。

3．培养液

(1）接种培养液：RPMI 1640+10% FCS+O.5mg/L PHA+200 OOOU/L IL-2+10g/L谷氨酰胺+10万U/L青霉素+100mg/L链霉素+1 mmol/L丙酮酸钠；

(2）饲养细胞培养液：RPMI 1640+10% FCS+10g/L谷氨酰胺+10万U/L青霉素+100mg/L链霉素+1 mmol/L丙酮酸钠；

(3) NK克隆培养液：RPMI 1640+10% FCS + 10g/L谷氨酰胺+10万U/L青霉素+l00mg/L链霉素+1 mmol/L丙酮酸钠，经0.2U滤板过滤再加入10万U/L IL-2;

(4）培养液：RPMI 1640+10% FCS；

4．饲养细胞自体或同种异体PBMC。

5.96孔细胞培养板、移液管、倒置显微镜、低温离心机、co₂孵箱。

【方法】

1. NK细胞的制备常规制备人NK细胞，悬浮NK细胞于接种培养液中，细胞浓度调至1x10⁶/ml 。

2．接种NK细胞

（1)常规制备PBMC作为饲养细胞。

(2)于4℃用800r/min离心饲养细胞12分钟后，用饲养细胞液重悬饲养细胞，细胞浓度调至2x10⁶/ml。

(3)用强度5OGy，γ射线照射饲养细胞，于4℃用800r/min离心饲养细胞12分钟，再用饲养细胞液重悬饲养细胞，细胞浓度调至2x10⁶/ml。

(4)在6块96孔培养板的各孔中加100ul上述饲养细胞悬液（总量用60ml饲养细胞悬液，含1.2x10⁸个饲养细胞），置37℃孵箱预温。

(5)将NK细胞悬浮于接种培养液中，于预温的96孔板中加入100ul NK细胞，使成为10个细胞／孔、5个细胞／孔和2.5个细胞／孔的3种类型板，并且每种类型重复2块板。

(6）将培养板置5% C0₂,37℃孵箱培养。

3. NK细胞的再刺激（接种后2～3天，主要依赖于饲养细胞）

(1)从每孔中轻轻移弃100 u1上清液。

(2）每孔中加入含有经照射的饲养细胞（2x10⁶/ml )的NK克隆培养液。其制备方法如下：

1)将饲养细胞移至50m1试管中，轻轻加入培养液30m1,混匀后用50Gy γ射线照射饲养细胞。

2)用800r/min离心饲养细胞12分钟，计数饲养细胞数量。

3)按细胞计数结果，将饲养细胞悬浮于NK克隆培养液中，调整细胞浓度为2 x 10⁶/ml。

4．换液（第6～8天）从每孔中轻轻移弃100ul上清液，加入新鲜NK克隆培养液100ul。

5．检测NK细胞的生长状况（第9～10天）如观察到有细胞生长，按第8天的操作换液。

6．分离克隆（第11～15天）

(1)当培养液颜色变黄时，证明细胞以已经生长，在96孔板上将生长的NK细胞按1孔分为2孔，2孔分为4孔，4孔分为8孔的方式分离克隆培养。

(2）在96孔板上扩增克隆，并重复第8天的操作。

【注意事项】

1. NK细胞克隆只生长在96孔板上，NK细胞总是用96孔培养板进行克隆培养。

2．需每天检查细胞生长情况。