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杂交瘤技术制备单克隆抗体

发布时间:2017-03-13 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1827

1975年Koehler和Milstein在体细胞融合技术的基础上创立了淋巴细胞杂交瘤(hybri-doma)技术,他们将丧失合成次黄嘌吟-鸟嘌吟磷酸核糖转移酶的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,融合的细胞不仅可以连续传代,而且能分泌抗绵羊红细胞的单克隆抗体,这项技术开创了医学与生物学基础研究的新纪元。杂交瘤技术具有周期长,高度连续的特点,涉及大量组织细胞培养,细胞免疫学和免疫化学等方法。

一、杂交瘤技术的原理

B淋巴细胞接受抗原刺激后,能分泌针对该抗原的特异性抗体,是重要的体液免疫细胞。B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞,通常不再进行细胞分裂。骨髓瘤细胞是恶性增殖的转化细胞,通过细胞融合技术将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,所产生的融合细胞既具有亲本骨髓瘤细胞的无限繁殖的生物学特性,又具有另一亲本B淋巴细胞合成、分泌特异性抗体的能力。

B淋巴细胞杂交瘤技术的原理可以从以下三个关键之处来阐明:首先是细胞融合剂的选择,使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤,使细胞易于相互粘连而融合在一起。最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇(PEG1000~2000)是目前最常用的细胞融合剂,一般应用浓度为40% (W/V)。其次,细胞融合的选择培养基中有3种关键成分:次黄嘌呤( hypoxanthine, H )、甲氨蝶吟( aminopterin, A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine, T ),所以取三者的字头称为HAT培养基。甲氨蝶吟是叶酸的拮抗剂,可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA,而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT-细胞株,所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能,能在HAT培养基中长期存活与繁殖。第三,细胞融合是随机的过程,在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体,需经筛选去除。筛选过程一般分为两步进行:一是融合细胞的抗体筛选,二是在此基础上进行的特异性抗体筛选,从而找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株,增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养,这一过程称作克隆化。

二、杂交瘤技术的基本程序和方法

(一)动物免疫方案

选择合适的动物免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的单克隆抗体至关重要。一般根据抗原性质、免疫原性和小鼠的免疫反应性决定注射途径、免疫次数、间隔时间和持续时间。选用6~10周龄,健康、发育良好的雌性BALB/c小鼠进行免疫,具体方案如下:

1.颗粒性抗原颗粒性抗原(如肿瘤细胞、淋巴细胞、细菌、病毒等)的免疫原性强,不加佐剂直接进行免疫,就可获得较好的免疫效果。如果是细胞性抗原,第一次腹腔或尾静脉注射1x107~5x107个/鼠,间隔2~3周重复注射1~2次,融合前3天用同样剂量腹腔或静脉注射加强免疫一次。

2.可溶性抗原可溶性抗原的免疫原性较弱,不论分子量大小,都应与佐剂混合后再进行免疫。如系半抗原,应先制备成人工免疫原,再加佐剂。佐剂对抗原起保护作用,并增强免疫效果。目前的免疫方案有:将可溶性抗原颗粒化或固相化,以增强抗原的免疫原性和降低使用剂量;使用细胞因子作为佐剂可以提高机体的免疫应答水平,促进免疫细胞对抗原是免疫反应性。蛋白质、荚膜多糖、病毒、立克次体以及与蛋白质结合的半抗原等均可采用可溶性抗原的方法免疫。

取1~100 ug抗原与等量完全福氏佐剂(CFA)充分乳化后腹腔或皮下多点注射。以后每隔2周以同样剂量抗原加不完全福氏佐剂腹腔或皮下注射,共3~5次。一般在融合前3天腹腔后静脉注射无佐剂抗原50~100 ug加强免疫,此时注射要缓慢,以免动物发生过敏性休克而死亡。

用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,例如:

(1)将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。

(2)改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。

(3)使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,促进免疫细胞对抗原反应性。

(二)饲养细胞(feeder cells)的制备

在体外细胞培养中,由于大量细胞相继死亡,此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活,通常必须加入其他活细胞使之繁殖,这种被加入的活细胞称为饲养细胞。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞。

小鼠腹腔巨噬细胞的制备方法如下:小鼠断颈处死,体表消毒后,用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜,用无菌注射器注射lOml培养液至腹腔。右手固定注射器,使针头留置在腹腔内,左手持乙醇棉球轻轻按摩腹部1分钟,随后吸出注入的培养液。置入lOml离心管,1200r/min离心5~6分钟,弃上清液。用5m1 HAT培养液重悬细胞,使细胞浓度为2x105/ml。一般饲养细胞在融合前一天制备,一只小鼠可获得(5~8)x106腹腔巨噬细胞。

(三)骨髓瘤细胞的准备

目前在我国最常用的细胞系为SP2/0和NS-1,均来自BALB/c小鼠骨髓瘤。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞,为确保该细胞对HAT的敏感性,每3~6个月应用8-氮杂鸟嘌呤筛选一次,以防止细胞的突变。骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下:

1.将刚复苏的瘤细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中,5% C02,37℃温箱孵育。每2~3天换液一次,3~5天传代一次,待细胞生长稳定后方可供细胞融合用。于融合前48~36小时,将骨髓细胞扩大培养(一般按一块96孔板的融合试验需2~3瓶100m1培养瓶培养的细胞进行准备)。

2.融合当天,用弯头滴管将细胞从瓶壁上轻轻吹下,收集于50m1离心管或融合管内。

3. 1000r/min离心5~10分钟,弃去上清液。

4.加入30m1不完全培养基,同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于lOml不完全培养基,混匀。

5.取骨髓瘤细胞悬液在倒置显微镜下观察,生长良好的细胞明亮呈圆形,排列整齐,形态完整,密度适宜(0.1x106~1x106/ml)。经锥虫蓝染色,活细胞数应大于90%。

(四)脾淋巴细胞的准备

取3d前加强免疫的BALB/c小鼠,摘除眼球采血,并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时断颈处死小鼠,置于75%乙醇中消毒5分钟,无菌操作取脾脏,制成单细胞悬液。取上述悬液,加锥虫蓝染液作活细胞计数后备用。通常每只小鼠可得1x108~2.5x108个脾细胞。

(五)细胞融合

将准备好的骨髓瘤细胞和脾细胞按1:5~1:10比例混合,加入不含血清的培养液,离心(1000r/min离心5分钟),弃上清液,用手指轻叩离心管底部,使细胞团成松散的糊状,置37℃水浴中,吸取1 ml 37℃预温的PEG溶液缓缓滴入离心管,1分钟加完。静置1分钟,滴加37℃预温的完全培养液1m1,1分钟内加完,而后加1640液至50m1使PEG作用终止。离心(1000r/min离心5分钟),弃上清液,将沉淀细胞轻轻悬浮于所需容积的HAT培养液,接种24孔或96孔培养板,置5% C02,37℃温箱培养。

(六)选择性培养

融合后每3~5天换一次HAT培养液,每次吸出培养孔1/2旧液换入新液,连续2周。3~5天后未融合及自身融合的细胞逐渐死亡,1周左右可出现克隆,并不断增殖,当集落大于3mm或布满孔底1/2时,即可取上清液作抗体活性检测,同时补加新鲜HAT培养液。在一次较好的融合试验中,70%~80%孔有克隆生长。所所有生长克隆的孔均应取上清液进行抗体活性检测。培养3周后即可改用普通完全培养液。

(七)杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化

1.杂交瘤阳性克隆的筛选并非所有的杂交瘤细胞都能分泌针对目的抗原的特异性McAb,因此,必须通过可靠、简便、快速的方法进行筛选和克隆化。具体方法依抗原性质及抗体类型而定。常用的方法有酶联免疫吸附试验、间接血凝试验、放射免疫测定、直接和间接荧光抗体技术以及免疫酶斑点试验等。

2.克隆化技术为确保McAb的纯一性及无关克隆的过度生长,要将阳性的杂交瘤细胞进行单细胞分离培养,产生单克隆杂交瘤细胞。经反复2~3次检测均为阳性的杂交瘤细胞,应及早进行克隆化培养。常用方法有:有限稀释法(limiting dilution, LD )、软琼脂法、直接挑取法及荧光激活细胞分离仪(FACS)分离法。以LD法最为常用,效果好,简便。

(1)有限稀释法:将细胞重悬,收集计数。按105,104,103,102到101的密度用RPMl 1640作系列稀释(最后一次用完全培养液)。取一块96孔板,预先按每孔105~106/100ul完全培养液加好饲养细胞,然后加入8~10/ml的低密度细胞悬液,每孔100ul,置5% C02,37℃温箱培养7~10天,其间尽量少作观察。之后,选择单个克隆生长的阳性孔再一次进行克隆。一般需要如此反复3~5次,直至达100%阳性孔时即可。

(2)软琼脂法:是将细胞置于琼脂糖凝胶半固体培养液中增殖的方法。将杂交瘤细胞培养在软琼脂板上,待单个细胞形成群落后,再用吸管吸出,反复吹打以分散细胞。将吸出的细胞移入小孔中继续培养。用这种方法可以吸出大量克隆进行增殖和分析。

(八)杂交瘤细胞的保存与复苏

将已克隆化和经鉴定合格的杂交瘤细胞株,或是一时来不及克隆化和鉴定的一部分杂交瘤细胞及时冻存是十分重要的。因为在细胞培养过程中随时可能发生细胞被污染或分泌抗体的功能丧失等情况。目前细胞均采用-196℃液氮冻存,以保持其特性和活性。

1.杂交瘤细胞的冻存收集培养的杂交瘤细胞或从小鼠瘤体内取出的杂交瘤细胞,加入一定量的细胞冻存液(30%~40%小牛血清,50%~60%不完全RPMI 1640培养液,10% DMSO),使细胞浓度为1x106~5x106/ml。将细胞悬液分装到冻存管中,用电脑程控冷冻仪降温或采用分步冷冻法:先置于-30℃冰箱1小时,再移至-70℃冰箱2小时以上或过夜,最后置液氮中;或将盛有冻存管的不锈钢提筒置于液氮罐口,以1 cm/min的速度下降,直至没入液面下。杂交瘤细胞可在-80℃低温冰箱存活6~9个月,在-150℃深低温冰箱或液氮中可存活数年。每种细胞株至少冻存5~10支。

2.杂交瘤细胞的复苏培养将杂交瘤细胞的冻存管从液氮罐里取出,立即投入38~40℃水浴杯中,待细胞解冻后,立即将细胞用RPMI 1640液清洗2次,然后用RPMI 1640完全培养液配成细胞悬液滴入24孔培养板或25 ml培养瓶,置5% CO2,37℃温箱培养。待细胞生长良好时,2~3天传代培养。若冷冻后死亡细胞较多,可加入饲养细胞共同培养。在复苏冷冻细胞前一天,于24孔培养板每孔加小鼠腹腔巨噬细胞104/ml,0.5 ml。应定期(如1年)进行复苏检查杂交瘤细胞的再生情况,传代后再冻存。

(九)单克隆抗体的大量生产

大量生产单克隆抗体的方法主要有两种:

1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞,从上清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低,一般培养液含量为(10~60) ug/ml,如果大量生产,费用较高。

2.体内接种杂交瘤细胞,制备腹水或血清。

(1)取对数生长期的杂交瘤细胞按(1~3)x107/ml接种于小鼠背部皮下,每处注射0.2ml,共2~4点。10~20天后肿瘤长到一定大小后即可采血,从血清中获得单克隆抗体含量可达到1~10mg/ml。此种方法采血量有限。

(2)于BaLb/c鼠腹腔注射0.5ml Pristane(降植烷)或液体石蜡,1~2周后腹腔注射lx106个杂交瘤细胞,接种细胞7~10天后可产生腹水,处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中,一般一只小鼠可获1~10ml腹水。腹水中单克隆抗体含量可达5~20mg/ml,这是目前最常用的方法。

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