北京普天同创生物科技有限公司
白细胞介素在机体免疫应答过程中起着十分重要的作用。在基础免疫研究中,常需检测不同条件培养液中白细胞介素的活性,并探讨白细胞介素产生水平与免疫细胞表型、增殖、杀伤及其他功能的关系。在某些疾病时,体内白细胞介素及其受体表达可发生异常,与机体免疫功能低下或发生病理损伤有关,因此在临床免疫学中也越来越重视对白细胞介素及其受体的检测。此外,原核细胞和真核细胞中表达的重组白细胞介素或经过不同工艺纯化的产品需测定活性和含量。
根据检测原理和手段的不同,白细胞介素的检测技术大致分为三类,即生物学方法、免疫学方法和分子生物学方法。这里着重介绍和细胞培养技术相关的生物学检测方法。
(一)IL-1活性测定
【原理】
IL-1和小鼠的胸腺细胞共同培养(含有适量的如PHA类的丝裂原),IL-1可刺激小鼠胸腺细胞增殖。由于许多品系的鼠胸腺细胞都对LPS有反应,但C3H/Heij品系小鼠胸腺细胞对LPS无应答,故通常选用C3H/HeJ品系鼠。
【材料】
1. C3H/HeJ品系小鼠(H-2K),6周龄,C57BL/6小鼠(H-2b);
2. RPMI 1640完全培养液;
3.刀豆蛋白A(ConA)用生理盐水配制2mg/ml;
4.脂多糖(LPS)用Hank液配成lm岁ml;
5. CS57BL/6或C3H/HeJ近交系小鼠,6~8周龄。
【方法】
1.无菌取出对LPS无反应的C3H/HeJ小鼠胸腺细胞,用Hanks液或RPMI 1640液洗涤2次,重悬于RPMI 1640培养液中,细胞浓度为(1~1.5)x107/ml。
2.加入低浓度ConA,再加入含IL-1的标本,以协同增强胸腺细胞对ConA刺激增殖反应的程度来判定IL-1活性,即将IL-1标本用完全培养液在96孔板上作倍比稀释,每孔50ul,一种稀释度设3个复孔。
3.每孔中加入胸腺细胞悬液100 ul和ConA (2~3ug/ml)的完全培养液50ul,培养系统中ConA的最终浓度为0.5~0.750ug/ml(或加PHA至浓度为1 ug/ml)。
4.将培养板置于5% C02,37℃孵育箱中培养60小时,每孔加入18.5kBq的3H-TdR各10ul(放射比活性13 Ci/mol),继续培养2小时。
5.用多头细胞收集仪收集细胞,液体闪烁器测量掺入细胞的3H-TdR量,以每分钟脉冲数(cpm)表示。
【结果】
以cpm对不同稀释位数的IL-1标准品作标准曲线,有良好的线性关系。参照标准曲线可得出样品IL-1含量。
【注意事项】
1. ConA浓度应合适,否则IL-1活性不易检出。
2.利用透析法将小分子抑制物除去,以免影响试验结果。
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