（一）细胞毒性法

TNF细胞毒性测定的基础是它对某些细胞株的直接杀伤作用，如小鼠成纤维细胞系1929 , WEHI 164、小鼠结缔组织细胞L-K等，TNF能使敏感靶细胞发生形态上的病变，直至死亡。细胞毒性法正是通过靶细胞被杀伤的程度来测定TNF活性。

染色法是一种经典方法，操作简便，直观易行。常用的染料有中性红、结晶紫、锥虫蓝、氨基黑蓝、奈酚蓝和吉姆萨染料等。以中性红为例，它可使活细胞染上颜色，再用脱色液将染料脱出，通过测定其A值来间接反映出TNF的生物活性。

【材料】

1．待检血清；

2．对数生长期的L929细胞；

3．全培基（RPMI 1640+10％小牛血清+1% HEPES+青霉素100U/ml、链霉素100 ug/ml)；

4. 0.5％中性红染液；

5．脱色液0.lmol/L Na₂P0₄和90％乙醇定量混合；

6. 96孔细胞培养板，酶标仪。

【方法】

1．用全培基调整L929细胞浓度为2x10⁵/ml,

2．将待测样品加到96孔板中，每孔100ul，每个样品做3个复孔，依次以1:1,1:2,1:4...1:64倍比稀释，然后每孔加入L929细胞悬液100ul，同时设正常细胞组（不加TNF样品）和空白对照组。

3. 37℃,5% CO₂环境中培养16～24小时，用生理盐水洗3次，每孔加中性红染液200ul, 37℃培养1小时。

4．用生理盐水洗3次，晾干，每孔加脱色液150ul,5分钟后，以酶标仪测定各孔A530 nm值，并计算各孔细胞死亡率及样品中TNF的活性。一般将50％细胞死亡的TNF最大稀释倍数定为1 U/ml。

（二）核素法

【原理】

放射性核素具有灵敏度高的优点。根据实验原理的不同，又可分为释放法和掺入法两种。前者是用³H-TdR或Na₂⁵¹CrO₄预先标记靶细胞，经TNF作用后，细胞遭受损伤溶解，其中的核素标记物被释放出来，因此可用上清液中³H或⁵¹Cr的放射活性来指示细胞被杀伤的程度。后一方法是根据TNF作用后，存活靶细胞对^l4C标记的氨基酸，³H-TdR或¹²⁵Ⅰ标记脱氧尿嘧啶的掺入量来反映存活细胞的数量，进而计算出TNF的细胞毒活性。下面以³H释放法为例简述之。

【材料】

1．待测样品；

2．长成单层的L929细胞；

3．全培基同前；

4. ³H-TdR370kBq/ml, 0.5% SDS；

5．液闪检测仪。

【方法】

1．在25 cm²的细胞培养瓶中培养L929细胞，使其长成单层。

2．加入³H-TdR使其终浓度达37kBq/ml，继续培养3天后用预温细胞培养液洗3次。

3．加入TNF待测样品，37℃,5% CO₂环境培养18小时，离心（1000r/min,5分钟），测上清中cpm值，计算特异性杀伤能力（即细胞毒作用），同时设最大释放组（将标记好的L929细胞培养瓶中加入0.5% SDS，作用30分钟）和自发释放组（标记好的L929细胞瓶）。

【结果】

最新研究发现，经TNF作用的细胞会出现凋亡现象,DNA被降解成碎片，据此可在TNF作用后收集存活细胞，用玻璃纤维滤膜进行负压过滤，由于死亡细胞的DNA都已被降解成碎片，经洗涤穿过滤膜去除，因此所测得的放射性剂量对应于存活细胞中完整DNA分子上所标记的³H-TdR，它反映了存活的靶细胞数目，具有更高的信噪比和灵敏度。

（三）MTT比色法

【材料】

1．待测样品；

2. L929细胞；全培基同前；

3．放线菌素D(100ug/ ml)；

4. 0.01 mol/L PBS缓冲液（pH 7.2)；

5. MTT应用液（5 mg/ml)；

6. 20% SDS+50% DMSO（溶解液）；

7. 96孔细胞培养板，酶标仪。

【方法】

1．将L929细胞配成1.5x10⁵/ml的细胞悬液，按100微升／孔分别加入到96孔培养板中。

2．在上述各孔中加入等量不同稀释度的TNF待测样品，再加入放线菌素D使其终浓度达1ug/ml。

3. 37℃,5% C0₂环境中孵育24小时后弃上清液，用0.Olmol/L PBS洗2次。

4．于每孔中加5mg/ml的MTT应用液10微升／孔，再加培养液100微升／孔。

5. 37℃,5% CO₂环境中继续培养3～6小时后，加溶解液100微升／孔，吹打使颗粒充分溶解，用酶标仪测A值，检测波长570nm，参考波长630nm，实验中应设不加TNF样品的对照孔。细胞毒活性检测法还有荧光法、电子颗粒计数法、集落形成抑制法、乳酸脱氢酶法和氨基己糖苷酶法等，但都或多或少存在局限故不再详述。

【结果】

另外，还可采用放射受体分析法检测大批量样本，来源于人组织细胞淋巴瘤U-937细胞的表面含有大量TNF受体，可与TNF特异高效地结合。通过被检样品中TNF分子与放射性核素标记的TNF对U-937细胞上TNF受体的竞争性结合，即可测定样品中TNF含量。本法信噪比及特异性均高，且快速简便，但灵敏度略低，适合大批量临床标本的检测。