贴壁细胞药物摄取实验
来源/作者:中国标准物质网  日期:2017-03-14

贴壁细胞的药物摄取实验应用更为广泛,通过实验可以了解转运体对药物的摄取动力学特征,预测药物在体内的吸收、分布、排泄等过程。贴壁细胞来源广泛可以是培养的新鲜组织细胞(如肝细胞)、肿瘤细胞(如应用广泛的Caco-2细胞)、转染特定转运体的转染细胞等。近年来随着分子生物学的发展,特别是转染细胞如OATl-, OAT3-HEK293细胞、OATPIBI-, OATPIB3-HEK293细胞、OATP2Bl-CHO细胞、Oatpl-Xenopus oocyte细胞、PEPT1-Hela细胞等,已经成为药物转运研究和新药开发的重要工具。

【材料】

1.贴壁细胞若干。

2.取试剂胰蛋白酶小牛血清、非必需氨基酸、培养基(DMEM培养粉或RPMI 1640,M 199等),0.4%锥虫蓝、待测药物溶液、24孔板、Krebs-Henseleit液(118mM NaC1,23.8mM NaHC03,4.8mM KCl,1.OmM KH2P04,1.2mM MgS04,12.5mM HEPES,5.0mM glucose,and 1.5mM CaC12,调节pH 7.4) ,Triton-X-100,BCA试剂盒。

3.仪器及试剂净化工作台、倒置显微镜、酶标仪、CO2培养箱、高压灭菌仪、恒温水浴振荡培养箱、高速冷冻离心机、高效液相色谱-质谱联用仪。

【方法】

1.细胞复苏与培养将装有细胞的冷冻管从液氮罐中取出,迅速放入37℃水浴中,快速摇晃,直至冻存管中冻存液完全融化后取出,以上操作在1分钟之内完成。乙醇消毒瓶盖后打开,吸出细胞液置于含有培养液的具塞离心管中,混合后低速离心,除去上清液,重复洗两次。接种于培养瓶中,在37℃ 5% CO2相对湿度90%的细胞培养箱中培养。

2.接种培养待细胞密度达到培养瓶面积的70%~80%时用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA混合消化液消化数分钟,再加入适量培养液,用吸管轻轻吹打细胞成单细胞悬液,调整细胞浓度接种于无菌24孔板中(1x105/孔),继续培养3~5天,待密度达到孔面积70%~80%可进行药物摄取实验。

3.用移液器将24孔板中培养液吸取干净,用预孵至37℃的Krebs-Henseleit液轻柔的清洗2遍,将细胞表面的培养液清洗干净。

4.用移液器将Krebs-Henseleit液(37℃)加入24孔板中(1毫升/孔)置于恒温水浴振荡培养箱中平衡10分钟。

5.用移液器将平衡液吸尽,加入1 ml含待测药物Krebs-Henseleit液(预孵至37℃)开始摄取实验。

6.达到预设的时间点用移液器吸尽药液,同时加入1 ml冷的Krebs-Henseleit液(0℃)终止摄取反应。

7.用移液器吸尽冷的Krebs-Henseleit液,用冷的Krebs-Henseleit液轻柔的清洗2遍以洗净细胞表面吸附的待测药物。

8.用移液器加入0.3 ml/孔的0.1% Triton X-100,37℃振荡裂解1.5小时。

9.取适量细胞裂解液按BCA试剂盒操作说明测定蛋白浓度,剩余裂解液放于-20℃保存;测定时经沉淀蛋白等处理后用LC-MS定量测定。

【结果与分析】

确定药物的线性摄取时间,作药物摄取量随时间变化曲线,从而确定线性摄取时间;根据确定的线性摄取时间,分别在37℃和4℃下进行药物浓度依赖性摄取实验,作药物摄取量随药物浓度变化曲线;由Eadie-Hofstee方程以特异性摄取初速度(υ)对初速度与药物浓度比值(υ/s)计算Km, Vmax,表征待测药物摄取的动力学特征。

【注意事项】

1.有些细胞在低代时容易贴壁,生长良好,在传到几十代以后,易聚集成团,且贴壁不牢,即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液,因此最好在购入时先大量冻存。

2.用于药物摄取实验的细胞应处于对数生长期,此期细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳,最适合进行实验研究。

3.有些细胞不容易贴壁或贴壁不牢,因此在药物摄取实验时用Krebs-Henseleit液清洗尽可能轻柔,防止其脱落。

【关键词】基酸 胰蛋白酶 小牛血清 乙醇