为了考察单一转运体对药物跨细胞转运的影响，近年来，研究者利用转基因技术，使MDCKⅡ或LLC-PK细胞高表达某个转运体，建立该转运体的细胞转运模型，从而更直观的观察其对药物转运的影响，探究转运体与药物的相互作用关系。应用转染细胞药物转运模型，能够减少其他转运体的干扰，方便快捷的得到特定转运体与药物的关系，从而预测药物的体内药动学行为，极大地推动了药物转运体的研究和新药研发的进程。例如hMDRI-MDCKⅡ或hMDRI-LLC-PK细胞转运模型，能够很好预测药物在透过血一脑脊液屏障的能力。目前，几乎所有已克隆的转运体都有细胞转运模型见诸报道，广泛应用于转运体研究领域和药物筛选开发过程中。

双转染细胞转运模型的建立，是药物转运体研究领域的又一重大突破。双转染细胞转运模型利用模型细胞的极性分化特性，将两种转运体基因转染表达于同一细胞的不同生物膜上，使药物从基底侧膜摄取进入细胞，再经顶侧膜外排转运体泵出，从而考察药物跨细胞转运的整个过程中转运体的功能和作用。这一模型不仅完美的解决了单转染细胞只有“进”或只有“出”的缺陷，还在形态学和功能上更加接近体内药物处置过程，是考察肝细胞和肾细胞处置药物的高效体外模型（图11-8)。近来，OATPs/OATS/OCTs等摄取型转运体表达于基底侧膜（血管侧膜）、MDR1/MRP2等外排型转运体表达于顶侧膜（胆管侧膜或肾小管刷状缘膜）的双转染细胞转运模型越来越多的应用于药物的胆汁排泄和尿液排泄机制研究当中。

下面，分别以单转染的MDRl-MDCKⅡ细胞和双转染的OATPIB1/MRP2-MDCKⅡ细胞为例（图11-9)，介绍转染细胞转运模型在药物与转运体关系研究中的应用。

【材料】

1．状态良好的mock-MDCKⅡ细胞（空质粒转染的MDCK Ⅱ细胞），MDR1-MDCK Ⅱ细胞，OATPl B1-MDCK Ⅱ细胞，MRP2-MDCK Ⅱ细胞，OATPIBI/MRP2-MDCK Ⅱ细胞。

2．试剂 胰蛋白酶、小牛血清、培养基（DMEM培养粉）、双抗。乳酸脱氢酶检测试剂盒、酚磺酞或荧光黄、D-Hanks液（每1000ml含NaCl 8.00g, KCl 0.40g，NaH₂P0₄·H₂O 0.06g, NaHC0₃ 0.35g，酚磺酞0.02g)、Hanks液（在D-Hanks液加MgS0₄·7H₂0 0.20g, CaCl₂（无水）0.14g、葡萄糖1.00g) ,75％乙醇。

3．仪器 净化工作台、C0₂孵箱、倒置显微镜、细胞计数板、电阻仪、酶标仪,TransweⅡ小室、HPLC/MS/MS（或核素标记检测）。

【方法】

1．转运模型的构建复苏MDCK Ⅱ系列细胞，培养方法同Caco-2细胞培养；显微镜观察MDCK Ⅱ系列细胞生长状态良好，形态规则，分化完好，边界清晰；同时，各种细胞生长速度一致，即可接种铺板。

将状态良好的细胞消化，吹打均匀，调节密度10⁴～10⁵/ml，吸取0.4ml细胞悬液接种于TransweⅡ小室，置于24孔板中，外孔加0.6ml培养液，内外孔液面大致等高。隔天换液。细胞模型培养3～5天，检测细胞单层完整性，即可用于转运实验。

2．细胞单层完整性检测常采用检测电阻和被动扩散标志物通透率的方法验证单层细胞的完整性，方法同Caco-2细胞单层完整性检测。MDCK Ⅱ系列细胞培养3～5天，TEER值可达到100～800Ω·cm²,酚磺酞等标志物的漏出量应小于5%，满足Pepp≤10-7cm/s。

3．细胞单层功能性检测常用转运体典型底物的转运考察转染细胞单层功能分化情况，单转染的MDRl-MDCKⅡ细胞采用Rhodamine 123或calcein-AM的转运，双转染的OATPIB1/MRP2-MDCK Ⅱ细胞采用E217βG(OATP1B1和MRP2的共同底物）的转运来考察。

也可采用RT-PCR和Western-Blot考察目的基因的表达情况，以此验证转染细胞的构建情况。

4．双向转运实验首先弃去TransweⅡ小室内外培养液，用37℃ Hanks液轻柔地清洗细胞表面3次以除去表面的杂质，然后加入37℃ Hanks（液内孔0.4 ml，外孔0.6m1)置于37℃孵箱中孵育30分钟。

吸去缓冲溶液，在AP侧（内孔）加入0.4m1含有受试药物的Hanks液，作为供给液，在BL侧（外孔）加入0.6m1空白的Hanks液作为接收液。此为吸收方向，A-B。

同时，另选其他小室，在BL(外孔）侧加入0.6m1含有受试药物的Hanks液，作为供给液，在AP侧（内孔）加入0.4m1空白的Hanks液作为接收液。此为分泌方向，B-A。

将载有TransweⅡ小室的24孔板于恒温摇床（37℃, 50r/min）中温孵，设定时间（0.5小时，1小时，2小时，3小时）从接受池取出50ul的接受液待测，然后补加相应体积的空白37℃ Hanks液。

转运实验结束后，夹出TransweⅡ小室，用冰冷D-Hanks液彻底冲洗，置入新的24孔板中，向小室内加入200ul裂解液，恒温摇床（37℃,50r/min）中裂解2小时。裂解液测定药物浓度和蛋白含量。

样品加等体积乙腈沉淀蛋白，涡旋，离心，吸取上清液吹干，流动相复溶，涡旋，离心，吸取上清液进样，质谱检测。蛋白含量用BCA试剂盒测定。

［结果与分析]

1．单转染MDRl-MDCK Ⅱ细胞转运模型结果分析应用MDRl-MDCK Ⅱ细胞转运模型进行药物的双向转运实验，须设置mock-MDCK Ⅱ细胞作为对照，同时考察药物在两种细胞单层的Papp。由药物的双向转运PaPP(A-B）和PaPP(B-A)，计算得到外流比（ER,efflux ratio)=Papp(B-A)/PaPP(A-B)。如果药物应用MDRI-MDCKⅡ细胞转运模型得到的ER大于1.5，则提示MDRI可能参与了该药物的外排转运。同时，为了排除野生型MDCKⅡ细胞对药物的基础转运，还应考察MDRl-MDCK Ⅱ细胞和mock-MDCK Ⅱ细胞的ER之比，称为净外流比(net efflux ratio)，该值也可反映转染细胞模型的构建情况（表11-1）。

2．双转染OATPIBI/MRP2-MDCK Ⅱ细胞转运模型结果分析应用OATPI B1/MRP2-MDCK Ⅱ细胞转运模型进行药物的双向转运实验，须设置mock-MDCK Ⅱ, OATP1Bl-MDCK Ⅱ细胞，MRP2-MDCK Ⅱ细胞作为对照，同时考察药物在四种细胞单层的PaPP。例如该模型的验证底物E217βG在四种细胞中的转运情况如图11-10所示。

E217βG是OATPIB1和MRP2的共同底物，单转染OATPlBl或MRP2的MDCK Ⅱ细胞和mock-MDCK Ⅱ细胞相比，对E217βG的转运没有明显的影响。如果考察转运后E217βG在细胞内的蓄积，可发现单转染OATPIBI-MDCK Ⅱ细胞内E217βG蓄积显著多于mock-MDCKⅡ细胞。应用双转染OATPIBI/MRP2-MDCK Ⅱ细胞，E217βG经OATPlB1摄入，再经MRP2泵出，外排率显著增大。

【注意事项】

1．铺板转染细胞转运模型需要使用两种或多种细胞，在铺板前须保证各种细胞状态相近，生长速度一致，这样才能保持相同的形成细胞单层时间，用于药物转运实验。同时，要防止细胞之间混淆污染，导致转运功能和属性的丢失。

2．确保的细胞单层完整性MDCKⅡ细胞单层完整性也可通过测定单细胞层电阻(TEER)、检测标志物被动扩散的跨膜通量、检测缓冲液中乳酸脱氢酶（LDH）含量变化等方法考察。

3．确保转染细胞的功能分化在铺板前，需要进行RT-PCR和Western-Blot实验，检测转染基因的表达情况，只有保持高表达转染基因才可进行转运实验。同时，应对建立的转染细胞转运模型进行典型底物的转运实验，以确定高表达的转运体能够正常发挥作用。