原代培养大鼠脑脉络丛细胞的药物转运实验
来源/作者:中国标准物质网  日期:2017-03-14

血脑脊液屏障( blood-cerebrospinal fluid barrier, BCSFB)形成的组织位于脑室内的脉络膜丛(choroid plexus epithelial cells, CPECs )。脉络膜上皮与其相邻细胞顶部表面依靠紧密连接来密封,这些紧密连接构成了血脑脊液屏障的结构基础。虽然有部分实验室建立了CPECs细胞系如Z310等,能够表达TTR,TfR,ABCCI,Oat3等转运体。但是目前CPECs多采用原代培养,主要技术要点是控制成纤维细胞的生长。转甲状腺素蛋白(transthyretin, TTR)是CPECs的特征性标志蛋白,常用来鉴定CPECs。原代培养CPECs接种在TransweⅡ上形成单层细胞屏障,培养5天后,跨膜电阻(100~180Ω·cm2)出现,培养约10天达到平台期,形成体外BCSFB单层细胞模型,用于药物跨BCSFB转运研究。

【材料】

1.实验选用新生SD大鼠,周龄较大的大鼠成纤维细胞污染几率更大。

2.试剂

(1)大鼠尾Ⅰ胶原或者小鼠层粘连蛋白,胰蛋白酶链酶蛋白酶,兔抗大鼠转甲状腺素(TTR)抗体,异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔IgG,3H-甘露醇等。

(2)生长培养液(终浓度):DMEM/F12培养基,双抗(100U/ml青霉素,100ug/ml链霉素),10%胎牛血清(FBS,已灭活),表皮生长因子(EGF, lOng/ml)。

(3)无血清培养液:DMEM/F12培养基,双抗(100U/ml青霉素,100Wml链霉素),表皮生长因子(EGF, lOng/ml),转铁蛋白(5 ug/ ml),胰岛素(5ug/ml),成纤维细胞生长因子(FGF,5ng/ml),氢化可的松(2ug/ml),亚硒酸钠(5ng/ml),谷氨酰胺(2mM)。

(4)低钠Tris/MES缓冲液:lOmM Tris/MES, 147mM氯化胆碱,2.4mM KCl, 0.5mM KH2PO4,1.1 mM CaC12, 0.85 mM MgCl2,0.5 mM Na2SO4 , 5.OmM glucose (pH 7.4)。

3.仪器 解剖显微镜,电阻仪,TransweII培养小室(0.4um孔径),培养皿,荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。

【方法】

1.脉络膜丛细胞的培养及药物转运实验脉络膜丛细胞的培养皿必须使用层粘连蛋白(或胶原、多聚赖氨酸)包被,包被后需要在无菌橱中风干,因此包被过程中要小心避免污染。脉络膜丛细胞的培养及药物转运实验操作流程见流程图(图11-13)。

2.药物血-脑脊液屏障转运实验药物通过细胞单层的膜和通过只覆盖了基质的膜所计算的渗透系数分别单层细胞渗透系数Pmono和空白滤膜对药物的渗透系数Pcorr因此,药物通过单层细胞膜的渗透系数需要校正。

【结果与分析】

1.细胞形态观察在倒置相差显微镜下,细胞未融合前呈梭形或多角形,5~7天细胞迅速生长并形成克隆,9~11天后细胞基本铺满培养皿,细胞形态为多边鹅卵石样,体积较大、透明度及折光性强,各细胞紧密相靠,互相衔接,融合成片而呈蜂窝状。

2.标志性蛋白表达转甲状腺素蛋白(transthyretin, TFR)专一性地表达于脑脉络膜上皮细胞,所以用抗TTR抗体进行免疫组化染色是鉴别其他来源细胞是否为脉络膜细胞的最可靠方法。

【注意事项】

1.控制成纤维细胞对于脑脉络膜丛细胞原代培养成败的考验就是控制成纤维细胞。主要有以下方式,第一、血清必须灭活,以减少FGF,血清量少于5%可以使细胞生长缓慢,因此一般选择10%~12%胎牛血清。第二、根据成纤维细胞污染的严重程度,选择不同的处理方式,可以选用特异性成纤维细胞抑制剂顺式羟脯氨酸(cis-HP ),但是加入的时间和浓度非常关键,一般在首次接种后48小时在培养基中加入25ug/ml。严重污染,采用黏附一弃掉法,一般黏附处理4~6小时为宜。第三、尽可能选择年幼大鼠,大于6周成纤维细胞污染几率增大。

2.为保证获得高产量的脉络膜丛上皮细胞,消化步骤非常重要。胶原酶容易使细胞活力下降,链酶蛋白酶消化的关键在于掌握消化时间和浓度,一般采用2mg/ml,也要根据酶活力而异,消化时间要根据组织块大小而不同,最重要是仔细观察培养液颜色变化。完全消化的时候,液体通常由亮红色向浅橙黄色转变,由相当透明向云雾状变化。机械化分离步骤必不可少,使细胞强行通过针头可以有效地粉碎细胞团,产生最大量的上皮细胞,缩短酶消化时间,减少对细胞的损伤。另外,培养液中采用胎牛血清也是细胞生长良好与否的重要因素。pH必须保持在7.2~7.4之间。首次接种的密度一般为1x105~2x105个/ml,不小于104/ml,以保证足够数量的细胞。在离心富集细胞后,将其由离心管向培养皿中转移的时候注意润湿管口,以减少吸附造成细胞损失。

3. Transwell培养除了细胞必须接种在层粘连蛋白包被的膜上以外,Transwell膜上脉络膜细胞的培养步骤与常规培养相同。可以存活2周以上。不同药物转运平衡时间差异较大,因此要经过预实验,保证足够时间是物质转运达到恒定的平衡状态。

4.模型鉴定不同实验室培养条件下可能差异非常大,因此实验中单层细胞模型必须进行鉴定。细胞种类鉴定包括形态学及TTR免疫荧光检测。脉络膜丛上皮在光镜下观察,在融合状态时呈致密的单层铺路石状镶嵌排列,细胞为多角形;或者电镜下细胞间紧密连接形成。胞膜上TTR免疫荧光染色显色阳性。单层细胞模型用于药物转运研究,必须鉴定TEER,一般报道100~180Ω.cm2,需要用未接种细胞的空白well校正。膜渗透性一般采用,H-甘露醇鉴定。涉及转运机制,相关的转运体也要鉴定。

【关键词】胰蛋白酶 链酶蛋白酶 异硫氰酸荧光素 链霉素