动脉平滑肌细胞（Arterial smooth muscle cells, ASMC）的收缩、舒张、增殖、迁移以及纤维化与高血压、动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等多种疾病存在密切联系；ASMC生长增殖的研究是探讨其发病机制的重要实验材料。ASMC培养技术还可用于药物作用机制的研究，如抗高血压、抗动脉粥样硬化、钙通道开放（拮抗）药物等的研究。尽管存在所培养的ASMC还未完全接近在体细胞的生物学特性和功能，然而，随着科学技术的进步，培养的ASMC的生物学特性将越来越接近在体细胞，不断为各学科领域的研究提供新的技术支持。

【原理和目的】

当血管内皮细胞受损时，单核细胞和血小板黏附并分泌细胞生长因子，可刺激ASMC增殖，使其氚标记脱氧嘧啶核昔酸（[3H]-TdR）摄取量明显升高，S期细胞核增多，影响丝裂原活化蛋白激酶(MAPK）活性；因此，在相同条件下观察细胞生长密度、DNA合成，可研究药物对ASMC生长的影响。MAPK是脊椎动物体内广泛存在的丝氨酸和（或）苏氨酸蛋白激酶，属于细胞外信号调节激酶。MAPK是体内重要的信号转导系统之一，能对细胞外刺激发生反应。多种细胞生理过程，如生长、发育、分裂、死亡以及细胞间的功能同步化等都涉及MAPK信号转导通路的调节。同时，MAPK通路也是Ras,PKC,PKA,G蛋白、酪氨酸蛋白磷酸酶和丝氨酸或苏氨酸蛋白磷酸酶等多条信号通路的汇聚点。外源性药物对ASMC 的培养的MAPK活性影响，可提示外源性药物是否可能通过抑制MAPK途径，友挥抑制ASMC增殖的作用。

增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA )是一种核内蛋白质，又称周期蛋白（cyclin)。它的出现与细胞增殖有密切的关系，在静止期细胞，其量很少，G1晚期开始增加，S期达到高峰，G2/M期明显下降，其量的变化与DNA的合成高度一致。而流式细胞术(flow cytometry, FCM）和免疫荧光组织细胞化学可分别定量测定PCNA, FCM是一种可以同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，定性或定量分析细胞；通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量进行检测。免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测细胞或组织内的相应抗原（或抗体），利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织位置，从而确定抗原或抗体的性质和定位，并可利用定量技术测定含量。

研究表明ASMC增殖，分化的机制对于防治ASMC增殖相关性疾病有重要意义。例如，抗高血压药物能够预防或逆转高血压伴随的血管壁增殖。无论是1型还是2型糖尿病，动脉粥样硬化性血管病变都是其常见的并发症。高血糖除可引起代谢障碍外，促进ASMC的增殖在动脉粥样硬化的发生发展中起重要作用。据报道，雷公藤红素、莲心碱、灯盏花素、丹皮酚、丹参酮Ⅱ A、大蒜素、银杏内酯B(GB)、西红花昔、酸枣仁皂昔A、重组水蛙素、莲心碱、雷公藤内醋醇、昆明山海棠、苦参总碱、姜黄素、葛根总黄酮、车前子多糖、大黄素、丹皮酚等均可抑制ASMC增殖。

【材料】

1．动物兔、大鼠等血管。

2．试剂 Millipore滤膜、胰蛋白酶、小牛血清、DMEM培养基、结晶紫、MTT,³H-TdR药盒、PCN A的单克隆抗体、Triton X-100、酸性异丙醇、戊二醛、锇酸、二甲亚砜、三氯醋酸PI染液、orthovanadate（一种非特异性酪氨酸磷酸抑制剂）。

3．仪器净化工作台、C0₂孵箱、透射电镜、倒置显微镜、液体闪烁计数仪、多孔扫描分光光度计、酶联免疫测定仪、电脑激光共聚焦系统、流式细胞仪。

【方法】

1．贴壁组织块培养在无菌操作条件下取出所需血管，以Hanks液洗去血污，在盛有Hanks液培养皿中剥离外膜，纵行剪开血管，剥去内膜，剪去两端夹钳过的组织，以锋利的虹膜剪剪成约1 mm³小块；用弯头种植针轻刺小块组织，以0.5 mm间距排列在培养瓶塞，在37℃,5% C0₂孵箱中静置5～7小时后，轻轻翻转培养瓶，使组织块浸泡在培养液中，放回培养瓶继续培养，每3天换液一次，一般4～7天细胞从组织块周围长出。2～3周出现致密的细胞层，这时取出组织块，使细胞生长至融合。

2．传代细胞培养当原代细胞生长融合成单层细胞时，倾去培养液，以Hanks液洗涤培养瓶2次，然后以0.25％胰蛋白酶-0.02% EDTA（乙二胺四醋酸二钠）混合液覆盖细胞表面，在室温下作用约2分钟，在倒置显微镜下见到大部分细胞收缩、边缘清楚时即翻转培养瓶停止消化，倾去消化液，加入含10％小牛血清培养液，用吸管轻轻反复吹打瓶壁，把细胞吹打成悬浮状进行细胞计数。以5x(10⁴～10⁵) /ml密度接种在新培养瓶中，在37℃,5% C0₂孵箱中培养，每3天换液一次，待细胞生长至致密单层时，进行第二次传代。

3．条件培养基的制备传代后的ASMC在底面积为25cm²玻璃培养瓶中生长融合后，再继续培养3天，用PBS (pH 7.4)洗3次，换成无血清培养基5m1,48小时后收集条件培养基，采用Millipore滤膜，孔径100kDa或10kDa，将ASMC条件培养基粗分为分子质量小于100kDa或小于10kDa两部分。离心10分钟，去除细胞碎片，-20℃保存。

4．实验设计ASMC一般传至5～6代，得到数量较大而又均一细胞，进行实验。按5x10⁵／孔的密度将细胞接种于6孔板中，待细胞达到70％～80％融合时开始试验。每次试验前将细胞置于无血清的DMEM液中孵育24小时。将ASMC分为对照组和受试药物不同剂量组：正常组（不加药和损伤剂），若干给药组（加不同剂量受试药物）。给药组细胞首先给含药培养液，每组8孔细胞，置于37℃,5% C0₂孵箱中孵育24小时，然后分别开展下面检测。

【结果与分析】

1．细胞鉴定

(1)倒置显微镜下观察：通过形态学观察鉴定细胞培养是否合格。原代培养的细胞经7～12天左右从组织块周围长出，呈放射状排列，镜下呈圆形或椭圆形，胞质密度高，不透明，胞核多为卵圆形，有多个核仁；细胞长出后的第14天左右，组织块间的细胞相互融合，生长速度减缓，细胞胞质透明，呈梭形、不规则形，生长汇合在一起，呈长梭形、放射性生长，成束的细胞平行排列；传代培养的细胞开始为悬浮状态，呈圆形，约24小时左右恢复梭形，贴附于瓶壁，数量逐渐增加，4～6天后长成致密细胞层，部分区域细胞多层重叠，部分区域高低起伏呈“峰、谷”状生长（图11-22)。培养的ASMC a-actin免疫荧光检测呈阳性，可见与细胞长轴平行的纤维细丝，即肌动蛋白丝（图11-23)。

(2）电镜技术观察超微结构：将培养瓶内单层融合的细胞，加入质量分数0.12％的胰蛋白酶消化，用D-Hanks液制成单细胞悬液，1000r/min离心8分钟，再用D-Hanks液以同法洗涤两次，加入质量分数3％的戊二醛4℃固定4小时，标本经D-Hanks液冲洗后，用质量分数1％的锇酸后固定1小时；常规丙酮梯度脱水，环氧树脂812包埋，钻石刀超薄切片，钢网捞片，透射电镜观察并摄片。电镜技术观察ASMC超微结构为：细胞核清晰可见，染色质边集，细胞核边缘呈锯齿状，胞质中见丰富的内质网、核糖体和少量的线粒体，其他细胞器不友达。

2.结晶紫染色法和MiTT比色法进行定量细胞量、用3H-TdR放免法测定细胞增殖：五、抗动脉粥样硬化药物对培养细胞的影响中的（二）血管平滑肌细胞增生抑制药试验。

3.荧光免疫组织化学定量检测ASMC的PCNA表达 将培养的3～5代细胞爬片用4％多聚甲醛固定30分钟，放入0.3 % PBS-H202，保持30分钟以除去内源性过氧化物酶活性，然后按SABC法（strept avidin-biotin complex）进行PCNA的荧光免疫组织化学染色，第一抗体为PCNA的单克隆抗体（1200稀释），在4℃冰箱内孵育24小时，二抗为生物素化抗小鼠IgG(1:200稀释），室温孵育2小时，SABC-荧光Cy3按1：100稀释）室温下孵育1小时，正常兔血清取代第一抗体、作阴性对照，甘油封片，置电脑激光共聚焦系统下扫描观察，每片选3个视野，计算其平均荧光强度。

4．流式细胞分析测定细胞周期和增殖指数将消化配制好的细胞悬液（浓度为1x10⁴/ml移入12孔板，每孔1.5m1，长成单层的ASMC后换成含25m1/L小牛血清的DMEM培养液，同时加入不同浓度的受试药物继续培养48小时，用胰酶消化离心收集细胞，并用0.0l mol/L PBS洗涤2次，70％乙醇固定20分钟，调整细胞密度为1x10³/ml，上机前用PBS洗涤2次以去除乙醇，并用含RNA酶的PI染液44℃孵育30分钟，用流式细胞仪测定细胞周期。在流式细胞仪上，用488nm激发光检测细胞DNA含量，并输入Muticycle A软件对DNA细胞拟合分析，计算细胞DNA组方图各时相分布的百分比，以增殖指数（proliferation index,PI）表示细胞的增殖活性，公式如下：

PI=［（S+G2/M)］／［Go/G1+S+G2/M］。数据采用F+Q检验。

5. MAPK活性测定采用含有1 mmol/L的orthovanadate的冷PBS冲洗细胞，加入300ul RIPA裂解液（radio immunoprecipitation assayLysis Buffer, RIPA Lysis Buffer）后立即置液氮中冷冻。培养皿首先在冰中冻融，超声波降解，然后于4℃ 16 OOOr/min离心20分钟；取50 ul上清液加入兔抗MAPK多抗（2ul)4℃ 2小时，再加入50 ul的蛋白A琼脂糖，4℃振动孵育1小时，用抗MAPK抗体通过MAPK的两个异构体ERK-1和ERK-2鉴定。免疫沉淀物用1ml溶解液冲洗3次，用激酶缓冲液冲洗2次，免疫沉淀物悬浮于45ul激酶缓冲液中，再加入5ul[γ-32p]-ATP(50umol/L),30℃ 20分钟。沉淀物点于P18磷酸纤维素滤纸上，滤纸用 PBS冲洗5次，乙醇冲洗1次，测定掺入到髓磷脂碱性蛋白（MBP）中的量；空白样品用缓冲液代替样品h, MAPK酶活性用pmol/(min/mg protein)计数。细胞活性用锥虫蓝染料排斥试验测定；蛋白量用Bradford技术定量。

6．统计学处理采用SPSS 软件进行统计学处理，配对资料采用t检验。药物影响动脉平滑肌细胞实验设计流程见图11-24。

【注意事项】

1．做好取材前的准备工作，包括培养液、缓冲液等试剂的准备，手术器械和培养器皿的清洗、消毒，实验动物的准备等。

2.培养基需采用新鲜3次蒸馏水配制，ASMC细胞耐酸不耐碱，因此要求培养液的PH调整到7.0左右；小牛血清质量与实验关系密切。有条件可加入血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF）等细胞生长因子。在加入药物前，以0.4％小牛血清培养液培养细胞48～72小时，然后改换10％小牛血清培养液，可使细胞对药物敏感性增高。

3.要严榕无菌操作，包括培养室环境消毒与操作台面的消毒，处死的实验动物应该用75%乙醇浸泡消毒，取材时严格无菌操作；为减少污染机会，可将剥离好的血管放入装有培养液的青霉素小瓶中，再用眼科弯剪反复剪成小组织块。

4. ASMC取材广泛，年幼动物的组织块有更好的增殖潜能，原代培养成活率高。

5．分离中膜时，要彻底剥离内膜与外膜，以减少内皮细胞和成纤维细胞的污染。

6．组织块的大小间距要适中，组织块不应剪切过小，lmm²最合适，否则组织块损伤大，水分容易丧失，导致原代培养失败。组织块间距需2～3mm，以保证细胞从组织块游出后有足够的生长空间并保持局部细胞密度的均匀，从而获得更多的原代细胞。

7．尽量缩短取材时间，时间越短，成功率越高。家兔腹主动脉较细，而且与下腔静脉伴行，分离时动作一定要轻柔，避免过分牵拉血管对血管过度损伤，或者撕破血管致大出血，使视野模糊不清，不利于快速取材。

8．原代培养初期，当部分组织块漂浮未贴壁，可将其重新放至瓶底，翻转干涸2～3小时后，使其重新贴壁，再浸没于培养液中。该法不会影响同瓶中其已萌出细胞的生长。

9．铺瓶后，第一次翻正瓶子的时间控制在2小时，但具体还要看铺瓶时组织的浸润程度，之后至少2天内不要移动培养瓶，以避免铺上去的组织块脱落悬浮。

10．细胞传代时，酶消化时间不应固定或硬搬他人经验，应在镜下观察至胞质回缩、间隙增大时及时终止消化。

11．细胞的纯化方法一般分为两大种类：自然纯化和人工纯化。自然纯化即利用某一种类细胞的增殖优势而排挤其他细胞生长，靠自然增殖潜力最后留下生长优势细胞。前期对血管的内膜和外膜进行剥离，原代培养时虽为多种细胞混杂生长，但ASMC仍占绝大多数。随着传代次数的增加，ASMC可排挤其他细胞的生长。

另外，综合运用2种人工纯化细胞的方法效果良好。用机械刮除法去除了小范围生长的特殊形态的内皮细胞。成纤维细胞与ASMC形态上难以鉴别，利用两者贴壁的时间差，反复贴壁可去除成纤维细胞。一般最终5代左右ASMC的纯度达98％以上。