自身免疫性疾病（autoimmune diseases, AID）是机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。目前缺乏有效的根治手段，部分AID患者死亡率较高。造血干细胞移植疗法治疗AID即通过大剂量化疗或射线照射摧毁患者的免疫系统、去除免疫活性细胞克隆，然后输入异体或自体造血干细胞，重建造血和免疫系统，从而达到治疗自身免疫性疾病的目的。目前干细胞移植疗法治疗AID已进入临床应用阶段，成为自身免疫性疾病的一种新的治疗方法。

【材料】

1．组织来源自体或异体骨髓与外周血。

2．造血干细胞采集、分离用试剂生理盐水、肝素、G-CSF、环磷酰胺、抗人CD34⁺单克隆抗体标记微磁珠、FcR阻滞剂（人IgG)、甲泼尼龙。

3．实验器材骨髓穿刺针或多功能细胞单采仪，磁细胞分选仪，低温离心机，倒置显微镜，净化工作台，流式细胞仪，荧光显微镜，热合仪，洁净服，一次性注射器，一次性无菌纸巾，无菌口罩，无菌帽子，无菌手套等。

【方法】

1．取材

(1)骨髓造血干细胞采集：硬膜外麻醉或用1％的利多卡因分别在双侧的骼骨棘部位作局部麻醉，然后用骨髓穿刺针进行多点、多方向、多层面穿刺，用已抽取5 ml肝素的50ml注射器抽取骨髓血，将抽出的骨髓血缓慢贴壁注入无菌瓶中，同时不断晃动以使骨髓血与肝素充分混匀避免凝血。抽取300～400ml左右的骨髓血（单独异基因骨髓移植所需要有核细胞应达到3x10⁸/kg体重以上），抽取结束后，压迫穿刺点3～5分钟。包扎穿刺点，将供者送入病房观察。

(2）外周血造血干细胞采集：患者自体或供者采用环磷酰胺与G-CSF进行造血干细胞动员，环磷酰胺4g/m²，连续用2天。于停药后的第5天，注射G-CSF5-l0mg/kg。当白细胞超过5.0x10⁹/L及CD34⁺细胞超过0.2％时，采用多功能细胞单采仪进行外周血造血干细胞采集。处理循环血量10000m1左右。

2. CD34⁺细胞分离 将采集的干细胞悬液与6%羟乙基淀粉溶液按1:3比例混匀，室温静置30分钟。收集上层液并移入离心管中。4℃,2000r/min离心5分钟，弃上清液。混匀细胞，将细胞收集到一个离心管中，加入生理盐水至50ml。另取2支离心管，加入Ficoll-hypaque分离液，25毫升／管。将细胞悬液沿管壁缓缓加于细胞分离液的表面，25毫升／管。室温、1800r/min离心20分钟。收集单个核细胞层细胞，将单个核细胞移入另一离心管。加入生理盐水至50ml,4℃,2000r/min离心5分钟，弃上清液。混匀细胞，加入200ul的FcR阻滞剂以及抗入CD34单克隆抗体标记微磁珠200ul，充分混匀，4℃冰箱中孵育30分钟。生理盐水洗3次（2000r/min离心5分钟），将细胞调成2x10⁸/ml，用孔径30 um的尼龙网或过滤器去除细胞凝块，将细胞悬液加入到磁铁分离器上的分离柱中进行细胞分离，分离后用PBS洗分离柱3次。将分离柱从分离器上移下并放置在试管中，在分离柱的顶端滴注缓冲液1 ml，用分离柱配备的活塞加压冲下细胞，然后从免疫磁珠上洗脱细胞，生理盐水洗细胞3次（2000r/min离心5分钟）。

3．细胞鉴定 流式细胞仪检测CD34+ 细胞率，并检测细胞的锥虫蓝拒染率。

4．冻存 将细胞保存于含有6%羟乙基淀粉（HES)和4％人白蛋白的5％二甲基亚砜(DMSO)保护剂中，冷藏袋热合封口，冷藏袋迅速装入由微机控制速率冷冻仪的冷冻箱内，按程序降温速率降温，最后将冷藏袋放置于液氮罐中保存。

［附］羟乙基淀粉（HES)的配制方法：在140ml的Normosol中加入42g羟乙基淀粉，高压灭菌。分装于冷藏袋，热合封口。

5．临床应用

(1)预处理：患者提前进入层流病房，在预处理前3天，开始无菌饮食，并口服或静脉给予氟康唑(400mg/d）和万乃洛韦（500mg, 3次／天），同时口服环丙沙星（750mg, 2次／天）。采用BEAM（卡莫司+依托泊苷+阿糖胞苷+马法兰）联合ATG（抗胸腺细胞球蛋白）方案或环磷酰胺（CTX）联合抗胸腺细胞球蛋白（ATG）方案预处理。

(2）干细胞移植：40℃水浴复苏细胞，将细胞移入离心管中，1800r/min，离心5分钟，弃上清液。生理盐水将细胞调成一定浓度的悬液，静脉输注，并于造血干细胞植入当天开始于皮下注射G-CSF5 ug/kg，直到中性粒细胞计数连续3天超过1x10⁹/L后停药。

【结果】

造血干细胞移植后，造血功能及免疫功能够迅速恢复，多数患者不会出现严重的并发症，自身免疫性疾病能够完全缓解，相关抗体可以阴转。但部分病例可复发。

【注意要点】

1．处理过程中应注意碱化尿液、保护膀胱黏膜及保护心肺等重要脏器的功能。

2．异基因造血干细胞移植治疗自身免疫性疾病的复发率明显低于自体造血干细胞移植。

3．造血干细胞移植治疗自身免疫性疾病必须严格把握治疗规则。根据EULAR/EBMT1996年制定的关于外周血和骨髓造血干细胞治疗自身免疫性疾病的方案规定：①疾病本身的危险高于异基因移植风险，且年龄小于55岁的患者可进行异基因造血干细胞移植；②造血干细胞移植仅可用于治疗预后不良、死亡率高的自身免疫性疾病；③造血干细胞移植必须在不可逆的脏器损害出现前进行。