终末期肝病是指各种原因（包括肝炎病毒、乙醇、药物、免疫、遗传几、代谢等因素）导致肝功能极度减退甚至衰竭的一种病理状态。它是一种发病率和死亡率均较高的疾病。目前，肝移植是治疗终末期肝病的唯一有效手段，但由于费用高，肝源少，移植后终身服用免疫抑制剂等弊端，使肝移植的临床应用受到一定的限制。自体间充质干细胞移植治疗终末期肝病具有干细胞采集方便、痛苦小，移植后不需使用免疫抑制剂等优点，国内外已经有很多治疗的成功病例报道，间充质干细胞移植有助于延缓肝功能衰竭、改善患者的生存质量。

【材料】

1．组织来源骨髓、外周血、脂肪组织或脐带血与脐带。

2．干细胞定向分化培养用试剂生理盐水，肝素，表皮生长因子（EGF)，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)，肝细胞生长因子（HGF)，尼克酰胺，制瘤素M，地塞米松，胰岛素和转铁蛋白。

3．培养基配方和制备无血清培养基。

4．实验器材 二氧化碳培养箱，低温离心机，电动移液器，一次性刻度吸管，50m1离心管，15 ml离心管，骨髓穿刺针或多功能细胞单采仪，75cm²培养瓶。

【方法】

1．取材 采集骨髓、外周血、脂肪组织、脐带血与脐带。

2．间充质干细胞分离 骨髓血（同外周血、脐带血）或脂肪组织。

3．间充质干细胞向肝细胞定向分化培养

(1)间充质干细胞向肝细胞定向分化培养（方法一）：采用无血清培养基（可含10％供体灭活血浆或血清）将细胞调成悬液，按2x10⁵/cm²接种于培养瓶，置37℃,5% C0₂孵箱中培养3天，吸弃非贴壁细胞，加入新鲜培养基继续培养。培养10天左右，待贴壁细胞形成同质克隆后，吸弃培养上清液，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃放置2分钟左右进行细胞消化，消化时间可根据实际的消化情况判定。待细胞变圆形浮起，终止消化。将细胞悬液于4℃ ,2000r/min离心5分钟，弃上清液。无血清培养基将细胞调成悬液，按8000/cm²密度将细胞接种于新的培养瓶中，每3天换液。传代2次，待细胞长满后。胰蛋白酶消化细胞，37℃放置2分钟，收集细胞，4℃ ,2000r/min离心5分钟，弃上清液。生理盐水洗细胞2次，采用含20ng/ml的EGF和lOng/ml的bFGF的无血清培养基将细胞调成悬液，按（1.0～1.3)x10⁴/cm²的密度接种于培养瓶中，置37℃,5% C0₂孵箱中培养2天，吸出培养上清液，加入含20ng/ml的HGF和l0ng/ml的bFGF及0.61mg/ml尼克酰胺的无血清培养基，置37℃,5% C0₂条件下培养7天。然后采用含20ng/ml制瘤素M ,1umol/L地塞米松和50mg/ml胰岛素转铁蛋白（ITS+ premix)无血清培养基培养，每周换液2次，继续培养2周。取培养上清液5 ml进行检菌实验。胰酶消化细胞，细胞悬液2000r/min离心5分钟，弃上清液，加入生理盐水混匀，2000r/min离心5分钟，重复2次。细胞计数、用生理盐水调成一定浓度用于移植。

(2）间充质干细胞向肝细胞定向分化培养（方法二）：采用无血清培养基（可含10％自体灭活血浆）将细胞调成悬液，按2x105/cm2接种于预先用1% I型胶原包被的培养瓶，置37℃ ,5% C0₂孵箱中培养3天，吸弃非贴壁细胞，加入含200 ug/L的HGF和20ug/L的bFGF的无血清培养基，每3天换液1次。当培养瓶底长满细胞后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化进行传代，培养3周。取培养上清液5m1进行检菌培养。胰酶消化细胞，制成细胞悬液，经2000r/min离心5分钟，弃上清液，加入生理盐水混匀,2000r/min离心5分钟，重复2次。细胞计数、用生理盐水调成一定浓度用于移植。

4．细胞鉴定 间充质干细胞分化为肝细胞后，细胞的形态由多边形转变为圆形，并表达肝细胞标志物CK18和白蛋白。

5．应用间充质干细胞及肝细胞定向分化细胞的应用方法包括新分离的干细胞直接移植、扩增培养或定向分化培养后移植。细胞的移植途径是经股动脉插管至肝固有动脉，注射造影剂，观察肝内血管情况及有无占位病变后，将细胞悬液注入肝内。穿刺点加压包扎，术后24小时插管侧髋关节呈伸直位并制动，预防性应用抗生素3天。行肝动脉导管治疗后常规护理。

【结果】

1．间充质干细胞向肝细胞定向分化培养结果诱导培养24小时后，基质干细胞开始贴壁生长，贴壁细胞呈梭形；．培养3～4天可见细胞呈集落样生长，细胞排列成放射状向外分布，细胞为梭形或多角形；HGF和bFGF诱导培养21天，细胞呈长梭形并相互交织；于诱导培养的第7天开始可检测到AFP,TDO基因表达，第14天可检测到CK18基因表达。

2．间充质干细胞与肝细胞移植结果 移植12周后，患者的肝脏功能有明显改善。患者肝功生化检测结果显示谷丙转氨酶逐渐降低，总胆红素逐渐下降，白蛋白逐渐升高；患者凝血酶原活性不同程度升高。

【注意要点】

1．注意把握适应证，对于患有终末期肝病、生命体征不稳（呼吸，血压，脉搏），或合并严重消化道出血，严重肝性脑病、恶性肿瘤、严重感染、严重出血性倾向，或心、肺、肾等脏器功能衰竭的患者，不宜做间充质干细胞或肝细胞移植。

2．终末期肝病一次干细胞移植通常达不到理想的治疗效果，可根据病情及移植后的治疗效果选择移植次数。