I型糖尿病为胰岛素依赖性糖尿病，是由T细胞异常攻击胰岛细胞而引起的一种自身免疫性疾病。目前对症治疗是治疗糖尿病主要手段，常采用饮食、运动以及药物来降低血糖，但许多患者的血糖并不能得到有效控制，无法根治糖尿病和防止并发症的发生。将间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞并移植入糖尿病患者体内，可增加胰岛β细胞数量，阻止胰岛β细胞功能衰退，并促进胰岛功能的恢复。

【材料】

1．组织来源骨髓、外周血、脂肪组织、脐带血与脐带。

2.胰岛细胞定向培养用试剂生理盐水，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)，表皮生长因子（EGF)，肝细胞生长因子（HGF),2% B27,β细胞调节素，活化素A，烟酰胺（尼克酰胺），肝素，Hanks液等。

3．培养基配方和制备无血清培养基。

4．实验器材二氧化碳培养箱，电动移液器，一次性刻度吸管，50ml离心管，15 ml离心管，骨髓穿刺针或多功能细胞单采仪，低温离心机，培养瓶。

【方法】

1．取材采集骨髓血或外周血、脂肪组织、脐带血与脐带。

2．间充质干细胞分离骨髓血（同外周血、脐带血）或脂肪组织。

3．接种培养

(1)间充质干细胞向胰岛细胞定向分化培养方法：采用无血清培养基（可含10％供体灭活血清）将细胞调成悬液，按2x10⁵/cm²接种于培养瓶，置37℃,5% C0₂孵箱中培养3天，吸弃非贴壁细胞，加入新鲜培养基继续培养。细胞生长覆盖80％～90％瓶底面积时，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA液消化细胞并传代，传代3代后，吸弃培养上清液，加入用含l0ng/ml的bFGF,10ng/ml的EGF及2% B27的无血清培养基，37℃,5% C0²条件下培养6天，吸弃培养液，用生理盐水洗细胞2次，加入含10 ng/ml的R细胞调节素（betacellulin)、 l0ng/ml肝细胞生长因子（HGF),10ng/ml活化素A (activin A) ,10mmol/L烟酰胺及2% B27的IMDM培养液，继续培养2周。

(2）胰岛细胞的分离与纯化：收集定向分化培养细胞，2000r/min离心5分钟，弃上清液。无血清培养基重新悬浮细胞。在离心管中依次加入25%,23%,20.5%和11%的Ficoll-400分离液2ml，建立密度梯度，然后沿管壁轻轻加入细胞悬液。2000r/min离心5分钟，收集20.5％～11％界面上的细胞，Hanks液洗涤2次。再将纯化的胰岛细胞悬浮于无血清培养基中，37℃,5% CO₂条件下培养，隔日换液。继续培养3周，取5 ml培养上清液作检菌培养。收集细胞，1500r/min离心5分钟，弃上清液，加入生理盐水混匀，1500r/min离心5分钟，重复2次。细胞计数，用生理盐水调成一定浓度用于移植。

4．细胞鉴定间充质干细胞分化为胰岛细胞后表达IPF-1、分泌胰岛素及胰高血糖素，双硫腙染色结果为阳性，同时在胞浆内可检测到胰岛素。

5.胰岛细胞的应用将新分离的间充质干细胞诱导培养成胰岛细胞后进行移植，可通过肝内移植或肾被膜下移植等方法将胰岛细胞输入糖尿病患者体内。

(1)肝内移植：通过导管将胰岛细胞植入肝动脉，使植入的细胞进入并停留在肝血窦或窦前肝血管内。肝组织血运丰富，利于植入胰岛细胞的存活。同时，肝脏是糖代谢的重要器官，胰岛细胞移植于肝内有利于植入胰岛细胞生理功能的发挥，对糖尿病控制的效果明显优于其他部位的移植。肝内移植是国际上普遍采用的胰岛细胞移植方法。

(2）肾被膜下移植：对于不能承受肝内移植的患者，可在B超引导下将胰岛细胞移植到肾被膜下，将细胞植入肾包囊即可。此法操作比较简单、安全，移植费用较低。

【结果】

1．间充质干细胞向胰岛细胞定向分化培养结果培养24小时后少量细胞开始贴壁，培养3～4天可见细胞呈集落生长，细胞呈梭形或多角形；培养5～7天排列成放射状，细胞长出突起。继续培养10天左右细胞融合成片状单层。诱导培养6天左右，球形细胞团出现，2周左右细胞扩增迅速。

2.胰岛细胞移植结果部分患者在胰岛细胞移植后三个月左右，病情可出现好转。表现为胰岛素用量较移植前有不同程度的减少，混合餐C肽释放曲线下面积（AUCC)有不同程度增加。

【注意要点】

1．移植胰岛细胞的数量是影响疗效的关键。一般来讲，每公斤体重需移植6x10³个胰岛细胞。

2．诱导分化培养后，双硫腙染色阳性细胞应超过80%。

3.吖啶橙与碘丙啶染色，绿染率应达到90％以上。

4．胰岛细胞移植后24小时内，要严密观察患者生命体征。

5．单次胰岛细胞移植有时收不到良好的治疗效果，一般需要移植2～4次。

6．治疗糖尿病的药物需要继续使用一段时间，根据病情适当逐渐减量。

7. I型糖尿病分泌胰岛素的β细胞绝对缺乏，单纯胰岛细胞移植还难以完全撤除外源性胰岛素。

二、间充质干细胞在糖尿病足治疗中的应用

糖尿病足是较严重的糖尿病继发疾病之一。大部分糖尿病患者会出现下肢感染、下肢组织弹性下降等病变，进而出现下肢或足部溃疡，发展成为糖尿病足。糖尿病足坏疽的发生率约为0.9％～1.7%，致残率较高。传统治疗方法疗效不理想。临床研究证实，间充质干细胞能够在糖尿病足血管损伤部位分化为血管内皮细胞以形成新生血管，进而改善肢体血供、促使大部分溃疡愈合、增加踝肱指数、降低了截肢风险。间充质干细胞治疗糖尿病足的安全性和有效性已得到初步肯定。

1．取材采集骨髓、外周血、脂肪组织或脐带血与脐带。

2．间充质干细胞分离骨髓血（同外周血、脐带血）或脂肪组织。

3．间充质干细胞的应用新分离的间充质干细胞直接移植或扩增培养后移植，间充质干细胞移植治疗糖尿病足主要采用肌注法和导管介入血管腔内注射法。

(1)肌注法：进行腰麻或连续硬膜外麻醉后，在患肢局部多点注射干细胞，间距3x3cm²左右，进针深度为1.5～2cm，每点0.75～1 ml（细胞浓度1x10⁸/ml)，单侧小腿需40针左右，单肢细胞量不小于3x10⁹个。此法优点可直接作用于缺血部位。

(2）导管介入血管腔内注射法：局麻下经股动脉穿刺，将球囊导管植入患肢的动脉中，球囊封堵后，将干细胞悬液注入远端动脉，细胞量5xl0⁹个，注入前后用肝素盐水冲管以免栓塞。此方法的优点是干细胞可以经过脉管通道直接着床于末梢血管。

【结果】

干细胞移植后，患者患肢冷感、疼痛及足部溃烂等可得到不同程度的减轻，总有效率可达87%。一般来讲，多数患者于2周内患肢疼痛减轻或消失;7～30天冷感减弱;2～3个月溃疡可愈合，3～6个月新生血管网逐渐形成，患者足部皮肤色泽好转，行走间距延长，足部血流明显改善。但有的患者病情较重，不能在短期内达到治疗目的，须作多次间充质干细胞移植。

【注意要点】

1．严格把握糖尿病足间充质干细胞治疗的适应证与禁忌证

(1)糖尿病足间充质干细胞治疗的适应证为：①有间歇跛行且静息状态下踝肱指数（ABI)<0.6 ;②有静息痛、溃疡或坏疽者；③保守治疗无好转且不适合外科搭桥手术者。

(2)糖尿病足间充质干细胞治疗的禁忌证为：①血糖控制效果不好的糖尿病患者(HBAlc>6.5％和增生性视网膜病变）；②肿瘤患者及血中肿瘤标记物水平明显升高者；③严重心、肝、肾、肺功能衰竭或不能耐受干细胞移植手术者。

2．移植的细胞量对疗效的影响很大，每次移植的细胞总量应不小于10⁸个细胞；

3．于下肢缺血的早期和缺血代偿期进行干细胞移植，治疗效果优于缺血失代偿期的组织坏疽期。

4．干细胞移植后应尽早进行患肢的运动，有助于病情好转。