北京普天同创生物科技有限公司
乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的蛋白质,存在于正常细胞的胞质中,正常情况下不能透过细胞膜,细胞受到损伤时,细胞膜通透性增强,LDH即被释放到细胞外。细胞质内LDH减少,培养液中LDH增多,测定培养液中LDH活性或LDH漏出率可反映药物的细胞毒性。
LDH在有辅酶I携带氢的情况下,催化乳酸与丙酮酸之间的可逆反应,以乳酸为基质,在pH 10的条件下经LDH作用后,测定生成的丙酮酸的量,从而推知LDH的活性。
【材料】
1. 96孔培养板培养的待测细胞和对照组细胞。
2. 0.1 mol/L甘氨酸缓冲液。7.505g甘氨酸和5.85g的NaCl用蒸馏水溶解稀释至l000ml。
3.缓冲基质液。用70%乳酸钠溶液,0.1mol/L甘氨酸缓冲液125ml,0.lmol/L NaOH配制,然后加氯仿数滴后放到冰箱中保存。
4.辅酶I溶液。在2m1的蒸馏水中加入10mg的辅酶I制成,然后放到冰箱中保存。
5. 2,4-二硝基苯肼溶液。在l0ml的10mol/L的HCl中溶解20mg的2,4-二硝基苯肼并且移至l00ml的容量瓶内,以蒸馏水稀释至刻度处,并将其混匀后放入冰箱。
6. 0.4mol/L NaOH。
7.丙酮酸标准液。准确称取干燥的丙酮酸钠11 mg,置于l00ml容量瓶中,用0.1 mol/LH2S04将其溶解,并稀释至刻度,混匀,冰箱内保存待用。此标准液1 ml大约相当于1 umol/L丙酮酸。
【方法】
1.绘制标准曲线,具体操作如表13-3。
将其37℃水浴15分钟,各管加入0.4mol/L的NaOH 10m1,混匀,室温放置5分钟,以1号管为空白,440nm比色。
以LDH单位为横坐标,以各管光密度值为纵坐标,绘成标准曲线。
2.细胞培养液中乳酸脱氢酶的测定。具体操作如表13-4。
混匀后室温放置5分钟,以对照管为空白,440nm比色。
根据标准曲线确定细胞培养液中LDH的活性(U)。
【结果与分析】
通过直接比较每培养孔LDH的活性判定药物或毒物的细胞毒性。培养孔LDH的活性越高,表示细胞膜通透性越高,细胞受损伤越严重。
也可比较每培养孔LDH的相对活性(%),见公式13-11。
【注意事项】
1.培养细胞时要用无血清培养液,以排除血清的干扰,否则实验结果偏差较大。
2. LDH尽可能现取现测,如果收集的细胞培养液放置的时间过长,可能使LDH的活性下降,所测数据偏小。
3.同一批试验尽量用同一次配制的溶液,否则可比性较差。
4.测定的各管光密度若是太高,应对细胞培养液进行稀释。
5.比色应在15分钟内进行。
6.应确保每管反应时间的一致性。
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