北京普天同创生物科技有限公司

  • CNAS实验室认可证书
  • 标准物质定级证书
  • 豫南检测资质认定证书
  • 质量管理体系认证证书
  • 农产品资质证书
  • 伟业计量高企认证证书
  • 中国计量测试学会合作单位
新闻
  • 产品
  • 仪器
  • 新闻
  • 帖子
  • 课堂

在线客服

乳酸脱氢酶漏出率试验

发布时间:2017-03-16 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:3259

乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的蛋白质,存在于正常细胞的胞质中,正常情况下不能透过细胞膜,细胞受到损伤时,细胞膜通透性增强,LDH即被释放到细胞外。细胞质内LDH减少,培养液中LDH增多,测定培养液中LDH活性或LDH漏出率可反映药物的细胞毒性。

LDH在有辅酶I携带氢的情况下,催化乳酸与丙酮酸之间的可逆反应,以乳酸为基质,在pH 10的条件下经LDH作用后,测定生成的丙酮酸的量,从而推知LDH的活性。

【材料】

1. 96孔培养板培养的待测细胞和对照组细胞。

2. 0.1 mol/L甘氨酸缓冲液。7.505g甘氨酸和5.85g的NaCl用蒸馏水溶解稀释至l000ml。

3.缓冲基质液。用70%乳酸钠溶液,0.1mol/L甘氨酸缓冲液125ml,0.lmol/L NaOH配制,然后加氯仿数滴后放到冰箱中保存。

4.辅酶I溶液。在2m1的蒸馏水中加入10mg的辅酶I制成,然后放到冰箱中保存。

5. 2,4-二硝基苯肼溶液。在l0ml的10mol/L的HCl中溶解20mg的2,4-二硝基苯肼并且移至l00ml的容量瓶内,以蒸馏水稀释至刻度处,并将其混匀后放入冰箱。

6. 0.4mol/L NaOH。

7.丙酮酸标准液。准确称取干燥的丙酮酸钠11 mg,置于l00ml容量瓶中,用0.1 mol/LH2S04将其溶解,并稀释至刻度,混匀,冰箱内保存待用。此标准液1 ml大约相当于1 umol/L丙酮酸。

【方法】

1.绘制标准曲线,具体操作如表13-3。

将其37℃水浴15分钟,各管加入0.4mol/L的NaOH 10m1,混匀,室温放置5分钟,以1号管为空白,440nm比色。
以LDH单位为横坐标,以各管光密度值为纵坐标,绘成标准曲线。

2.细胞培养液中乳酸脱氢酶的测定。具体操作如表13-4。

混匀后室温放置5分钟,以对照管为空白,440nm比色。

根据标准曲线确定细胞培养液中LDH的活性(U)。

【结果与分析】

通过直接比较每培养孔LDH的活性判定药物或毒物的细胞毒性。培养孔LDH的活性越高,表示细胞膜通透性越高,细胞受损伤越严重。

也可比较每培养孔LDH的相对活性(%),见公式13-11。

【注意事项】

1.培养细胞时要用无血清培养液,以排除血清的干扰,否则实验结果偏差较大。

2. LDH尽可能现取现测,如果收集的细胞培养液放置的时间过长,可能使LDH的活性下降,所测数据偏小。

3.同一批试验尽量用同一次配制的溶液,否则可比性较差。

4.测定的各管光密度若是太高,应对细胞培养液进行稀释。

5.比色应在15分钟内进行。

6.应确保每管反应时间的一致性。

评论

登录后才可以评论

立即登录
分享到微信
关闭
普天同创
请告知您的电话号码,我们将立即回电

通话对您免费,请放心接听

温馨提示:

1.手机直接输入,座机前请加区号 如18601949136,010-58103629

2.我们将根据您提供的电话号码,立即回电,请注意接听

3.因为您是被叫方,通话对您免费,请放心接听