细胞毒性也可通过细胞形态变化来判断。形态观察是辨认细胞最简单、最直接的方法，因为其中大多数细胞的形态与药物或者毒物的作用有关系。细胞形态变化很难定量，但可通过形态变化程度分级，或根据形态改变细胞数所占的百分比进行半定量。细胞形态改变可在电子显微镜下直接观察，也可经染色后观察，苏木精一伊红（HE）染色和吉姆萨（Giemsa )染色是观察细胞形态的最常用的方法，也是把细胞作为标本保存的主要方法。

（一）倒置显微镜下直接观察细胞形态

细胞形态变化包括：细胞核、细胞膜和细胞质的改变，即细胞是否有空泡积累和脂质小滴、是否可见细胞膜膨出（鼓泡）、细胞核染色质的变化以及细胞器如线粒体、溶酶体等的变化、细胞脱壁和贴壁、细胞膜表面是否毛糙无光泽、细胞是否裂解为碎片等。通过细胞形态的这些变化，可直观快速地判断细胞毒性。

（二）透射电子显微镜观察

【材料】

1. 2％～3％琼脂糖。

2. 2％～2.5％戊二醛。

3. 1％四氧化锇。

4. 0.2M PBS缓冲液。

5．梯度丙酮。分别为50%,70%,90%,100％浓度的丙酮。

【方法】

1．收集对数生长期的培养细胞5x107左右。将细胞连同培养液放入2ml的离心管中，然后用PBS清洗2～3次，1000～1500r/min离心样品5～10分钟，吸去上清液，混匀细胞。

2．沿管壁小心加入2％～2.5％的冷戊二醛，轻轻吹打，使细胞混匀。在4℃的环境中固定30分钟，然后用指弹法将细胞团块弹散，继续用新的固定液固定细胞30分钟。1000r/min离心5分钟，弃上清液。

3．在4℃下用PBS冲洗后放置1～2小时或者过夜，离心后弃上清液。

4．管内加入0.1～0.5m1 37℃的2％～4％的琼脂糖液，混匀并冷却，形成细胞琼脂凝胶预包埋块。

5．离心管中加入少量的PBS或者75％的乙醇，用铝片沿管壁小心地将细胞琼脂糖松动，预包埋块移到含有75％乙醇的青霉素瓶中，一天后换固定液一次。4℃保存。

6．将预包埋块切成1 mm3大小，放到1％四氧化锇中4℃固定1～ 2小时。用PBS反复漂洗后放置30分钟或过夜。

7．分别用50%,70%,90%,100％的丙酮脱水一次，每次10～15分钟；然后100％丙酮脱水3次，每次30分钟。

8．浸入稀释包埋剂（丙酮：包埋剂=1:1)中，室温1小时。再放到纯包埋剂中，37℃过夜。然后60℃固定48小时。放置于干燥器中备用。

9．将样品放到电子显微镜进行透视观察。

（三）扫描电子显微镜观察

培养细胞电镜扫描观察非常方便；在观察铁壁细胞时也需要进行消化，制备成细胞悬液后，用Hanks液漂洗1到2次后，除去细胞碎块和血清蛋白，以防妨碍观察。

【材料】

1. 1.5％戊二醛。

2. 0.2M PBS缓冲液。

3. 50%,70%,90%,95%,100％的梯度乙醇。

4. 1％四氧化锇（Os0₄)。

5．丙酮。

【方法】

1．单层细胞盖玻片培养物冷漂洗后，用1.5％戊二醛4℃固定1～2小时。PBS液清洗3次，每次10分钟。

2．在4℃下用1 % OSO4固定1小时，然后用PBS缓冲液清洗3次，每次10分钟。

3．分别用50%,70%,90%,95%,100％的乙醇依次脱水，每个浓度的乙醇脱水2次，每次15分钟。

4. 100％丙酮脱水3次，每次30分钟。

5．将标本在4℃下用丙酮保存。

6．用扫描电子显微镜观察。

（四）苏木精-伊红染色（HE)

【原理】

苏木精一伊红（HE）染色是一种以形态为基础，结合应用化学技术对组织、各种细胞进行染色的实验技术，用于研究组织细胞的生理、病理和化学结构。正常情况下细胞核显酸性，易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染成鲜明的蓝色。伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞质染色，细胞质、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的鲜红色、粉红色或桃红色等，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。细胞的一般形态都能显示出来，有利于观察。

【材料】

1．待检的培养细胞。

2．中性甲醛溶液。

3．丙酮／二甲苯混合液分别配制2:1和1:2的丙酮／二甲苯溶液。

4．苏木精染液将0.5g的苏木精和24.Og的铵矾(NH4)2SO4AL2(S04)3)、0. 1g的碘酸钠（Na10₃)混合后溶于70ml的蒸馏水中，加入30ml的甘油和2ml的冰醋酸，混匀之后过滤，即得苏木精染液。用蒸馏水20倍稀释，将苏木精染液配制成工作液。

5．伊红0.5 g伊红溶于l00ml蒸馏水或70％乙醇即为工作液。

6. BSS。

【方法】（以盖片培养方法为例）

1．在37℃条件下，用BSS漂洗细胞3次，每次20秒～1分钟；然后用中性甲醛固定细胞30分钟。

2．先用蒸馏水洗涤细胞一次，再加入苏木精染液染细胞核5～10分钟。

3．用自来水洗涤后，放入1％的NaHC0₃溶液中漂洗至蓝紫色。

4．将细胞放入伊红溶液中染色30秒～1分钟。

5．用蒸馏水洗涤，后迅速将细胞通过丙酮2次，每次大约3～5分钟。

6．将细胞用2:1的丙酮／二甲苯洗涤3次，每次1～2分钟。

7．将细胞用1:2的丙酮／二甲苯洗涤3次，每次1～2分钟。

8．用纯的二甲苯处理细胞两次，每次5～10分钟。

9．把盖片放置到载物玻片上，用树胶封存，在上面覆盖较大的盖片（将小盖玻片细胞面向上，勿放反）。

【结果与分析】

细胞核被染成鲜明的蓝色，而细胞质则被染成浅红色。以此可以判断由于细胞毒性而造成细胞形态上的改变。

【注意事项】

1．染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。

2.伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染色细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。

（五）吉姆萨染色（Giemsa )

［原理］

吉姆萨染色（Giemsa）是最常用的染色方法之一，具有简便，快速等特点，适用于多种细胞和染色体的染色。正常情况下细胞核会被Giemsa染液染成紫红色或者蓝紫色，而细胞质则会被染成浅红色，因此细胞核和细胞质在颜色上就会形成鲜明的对比，有利于细胞形态的观察。

【材料】

1．待检细胞。

2．平衡盐溶液（PBSA)。

3．甲醇。

4．吉姆萨染液（Giemsa )。称取Giemsa粉末0.5g、甘油22 ml，在研钵内先用少量的甘油和Giemsa粉末充分混匀，然后研磨至无颗粒为止。将剩余甘油混合在一起，然后在56℃的条件下保温2小时，再加入33ml的甲醇，保存在棕色瓶中。将母液用0.1 M的中性PBS稀释10倍即为工作液。工作液最好现用现配。

【方法】

1．去除培养器皿内的培养液，用PBSA反复漂洗单层培养物2次，然后去掉冲洗液。

2．加入PBSA，再逐滴加入等体积甲醇，边加边混合，静置10分钟。

3．将50％甲醇混合液丢弃，加入新鲜的甲醇液浸泡固定细胞10分钟，然后用甲醇漂洗细胞1次。

4．将瓶内细胞干燥后储存或直接染色。即使是干燥的培养瓶，用新配的无水甲醇冲洗后直接染色也是非常重要的，如果甲醇倒出，培养瓶静置一段时间之后，残留的甲醇会吸收水分，从而妨碍下一步的染色，而且干燥的细胞也会从空气中吸收水分。

5．按2m1/cm²的比例滴加吉姆萨染液，覆盖细胞层，染色2分钟。

6．移除染液，用自来水冲洗掉粉红色背景后，再用去离子水冲洗细胞。

7．用显微镜观察单层潮湿细胞。若细胞已干燥，可重新使细胞潮湿后再观察。

【结果与分析】

细胞核被染成鲜明的蓝色，而细胞质则被染成浅红色。主要观察细胞核的形态变化，如细胞凋亡时的染色质浓缩、边集成新月形，细胞核碎裂成凋亡小体等均可明显观察到。

【注意事项】

1．染液宜现用现配，旧染液染色效果不佳。染液保存时间不宜超过48小时。

2．吉姆萨对pH极敏感，因此，缓冲液pH要准确，否则染色效果不佳。如用染色缸染色时，随染色时间的延长，在染液表面常形成一层氧化膜（发亮）易附着在玻片上形成污秽，且不易除掉。因此在用染色缸染色，尤其使用非现配染液时，染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化层再进行染色。染色完毕，应把标本浸入水中漂洗染液。

3．染色细胞必须经过乙醇或者甲醛的固定，制备过程中必须彻底的脱水，否则会影响细胞的着色。