本试验是一项致突变性试验，检测受试样品是否会引起哺乳动物细胞的原发DNA损伤，以评价受试样品的潜在致突变性。

细胞从DNA复制起，经过分裂直到DNA均等地分配到两个新的子细胞的过程即为细胞周期，包括G1期、S期、G2期和M期。S期的DNA合成是按固定程序进行的，称为程序性DNA合成。DNA受损后的修复合成与按细胞周期进展程序而发生的S期半保留DNA合成不同，称为程序外DNA合成（unscheduled DNA synthesis, UDS)。DNA修复是活细胞在DNA受到损伤后的一种生物学反应，也是细胞保持遗传物质稳定性的一种措施。因此，可以借DNA修复来判断DNA的损伤。

在加或不加体外代谢活化酶混合液（S9混合液）的条件下，将经受试样品作用后的同步培养生长于盖片上的细胞置于含有羟基脲的，H-TdR中，并进行放射自显影或液体闪烁计数显示法处理后，计数细胞核上乳胶层中的显影银粒数或计算³H/¹⁴C的放射活性比。

【材料】

1．恒温水浴箱、冰箱、生物显微镜。

2．阳性对照物7,12-二甲基苯蒽(7,12-demethylbenzanthracene,7,12-DMBA)。

或2-乙酞基氨基芴(2-acetylaminofluorene,2-AAF)。

或4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide,4-NQO)。

3．细胞培养液。

4．细胞株。各种细胞均可作为UDS的靶细胞，人类细胞（如外周血淋巴细胞、成纤维细胞、Hela细胞、人羊膜FL细胞）的UDS反应大于啮齿类细胞。由于肝脏是化学物作用的初级靶器官，又具有生物转化能力，故推荐使用原代肝细胞为UDS试验的靶细胞。

5．无钙镁磷酸盐缓冲液（CMF-PBS, pH为7.2～7.4)。

6．胰蛋白酶-EDTA溶液。

7．固定液甲醇：冰醋酸（3:1,v/v)，临用现配。

8.贮备液250mmo1/L羟基脲（HU)。

9. 1％枸橼酸钠溶液。

10. ³H-胸腺嘧啶核苷。

11．核乳胶。

12．显影液及定影液。

13．代谢活化系统。肝混合功能氧化酶混合液（S9混合液）。

【方法】

1. UDS放射自显影法

(1)将细胞增殖至所需数量后，制成单细胞悬液，浓度为0.5x10⁵～1.0x10⁵/ml。将细胞悬液接种于有小盖玻片的6孔细胞培养板中，在37℃ C0₂培养箱内培养1～3天，至细胞50％融合。

(2)在进行放射自显影技术前一日下午，加入羟基脲(HU)贮备液，HU的终末浓度为1Ommol/L。继续在37℃下培养16小时，然后将长有细胞的盖片置于含有不同浓度的受试样品、HU(1Ommol/L）及³H-胸腺嘧啶核苷(5～10 uCi/ml,30 uCi/ml）培养液中，在37℃下培养5小时。

(3)细胞的固定：孵育结束后，小盖玻片经Hanks液充分洗涤后，用1%枸橼酸钠处理10分钟。随后用乙醇-冰醋酸（3:1 V/V新鲜配制）固定液在4℃固定过夜，空气中干燥后，用小量中性树胶将小玻片粘于载玻片上，长有细胞面朝上，40℃烘焙24小时。

(4）放射自显影处理。放射自显影处理的全过程需要在暗室中安全红灯下或黑暗中进行。为了获得很薄的乳胶层，将市售的乳胶在临用时作1:1稀释。

(5）将乳胶液置于42℃水浴中。并不时用玻璃棒徐徐搅拌，使乳胶液中的空气逸出。10～20分钟即可使用。同时将准备做自显影处理的载玻片，置水浴箱平台上预热。而后，将附有样本的载玻片垂直浸渍于乳胶液中约5秒。徐徐将玻片提出（提出速度愈慢，乳胶层愈薄），并用纱布或擦镜纸将玻片背面乳胶拭去。

(6)已涂了乳胶的玻片移入温度为29℃并保持一定湿度的温箱中。待乳胶干涸（4小时）后，将玻片放入内置一干燥剂（变色硅胶）袋的玻片盒中。玻片盒严密地以黑色避光纸包裹，使完全不透光，置于一塑料袋中。然后移入4℃冰箱中曝光10天左右。

1)曝光结束后，将玻片移入有机玻璃制的玻片架上。在液温为19℃的显影液中显影5分钟，在停显液中漂洗30秒，再在F-5定影液中定影6～10分钟。用蒸馏水漂洗10～30分钟（换水4～5次），把水沥去，在空气中干燥。

2)细胞染色：可在放射自显影处理前用地衣红（Orcein) 2％冰醋酸溶液，或在显影后用Giemsa染液染色。将玻片用乙醇及二甲苯脱水透明后，用盖片封固。

3)镜检：在油镜下，计数各样本细胞核上乳胶层中的显影银粒数，至少计数50个细胞核，同时计数相当面积的本底银粒数，两者之差为细胞核净银粒数。

2. UDS液体闪烁计数测量法

（1)将细胞增殖至所需数量后，用培养液制成单细胞悬液，浓度为0.5x10⁵～1.Ox10⁵/ml。加入¹⁴ C-TdR (25 mCi/mmol)，使其终末浓度为0.0luCi/ml。将细胞接种于液体闪烁瓶中，1 ml/瓶。在37℃中培养48～72小时，除去培养基并用Hanks液洗涤细胞2次。换以含有¹⁴ C-TdR(0.0l uCi/ml）培养基，37℃培养2～3天。在试验前一天下午除去含标记物质的培养基，用Hanks液充分洗涤后，换以含1Ommol/L羟基脲的培养基。在37℃继续孵育16小时。

(2）细胞与受试样品接触和UDS的¹⁴ C-TdR标记。同放射自显影显示法。

(3)液体闪烁计数样品的制备。细胞经受试样品接触和UDS的³H-TdR标记后，迅速除去培养基，以冰冷盐水洗涤2次。随后用冰冷的0.25N过氯酸溶液处理细胞2次，每次10分钟，以固定细胞并除去酸不溶性组分。再用75％乙醇处理10分钟和无水乙醇洗涤1次以除去脂溶性成分。50℃充分干燥后加入0.5N过氯酸0.5 ml，于75％～80％恒温箱中水解40分钟，使掺入的标记物释出。冷却后加入乙二醇乙醚3.5ml及甲苯闪烁液（PPO 0.5%,POPOP 0.03%) 5 ml。振摇使成均相。或按下述方法制成支持物上的测量样品；细胞与受试样品接触和UDS3H-TdR标记结束后，迅速除去培养基，以冰冷盐水洗涤2次。加入0.02%EDTA之无钙镁磷酸缓冲液在37℃中孵育15分钟。用滴管反复吹吸使细胞自瓶底脱下，并抽吸至直径为2cm的玻璃纤维纸盘上。依次用0.25N过氯酸5ml,75％乙醇2ml、无水乙醇2ml抽吸洗涤后，在50℃恒温箱中将纸盘烘干。置于含3 ml甲苯闪烁液的液体闪烁瓶中。

(4）液体闪烁液计数。在进行样本中³H及14 C放射活性检测前，先选择好两个窗宽连续的测量道的窗宽。使较高能道（道1)只对¹⁴ C的高能量衰变脉冲计数，而在较低能道（道2）计数全部³H衰变脉冲及¹⁴C的较低能量衰变脉冲。在均相测量时，各道的计数效率可利用自动外标准源及预先绘制好的淬灭校正曲线推算而得。设道I中¹⁴C的计数效率为C₁（根据窗宽选择标准，³H在该道的计数效率h₁=0)、道2中³H和¹⁴C的计数效率分别为h₂及C₂。则¹⁴C及³H的放射活性（dpm）可自道1和道2的净计数值N₁及N₂（净计数值二实际计数值-本底计数值）求得。即¹⁴C (dpm)=N₁/C₁;³H(dpm)= (N₂-¹⁴C×C₂)/h₂。若所用液体闪烁计数器有在线微处理机，这些计算过程可自动完成。利用无外标准源的双道液体闪烁计数器或测量支持物上的样品时，先根据上述要求选择好窗宽，并测量出两道中¹⁴H计数效率比k(k=C₂/C₁)、¹⁴C的总计数效率C及³H在道2中的计数效率h₂。则¹⁴C(dpm)=N₁(1+k)/C,³H (dpm)＝（N₂-N₁×k)/h₂。

(5) DNA含量测定。

【结果与分析】

1. UDS放射自显影法UDS反应的是细胞核DNA的修复合成，因此细胞核上银粒数(NGs）和细胞质中银粒数（CGs）所代表的生物学意义不同。NGs可以反映UDS的程度，而CGs则为一般的细胞毒性线粒体DNA合成的选择性显示。所以，目前多用净核银粒数（NNGs）作为评价UDS的指标。其计算方法为：NNGs=NGs-CGs由于NGs和CGs受许多方法学因素影响，所以很难给出一个共同的结果判定阈值。建议以下两种方法任选一种进行试验结果阳性与否的评价。

(1)两个以上相邻受试组中出现NNGs的剂量依赖性增高。而受试组NNGs的增高与对照组相比差异有显著性。

(2）根据试验的可重复性、浓度一效应关系和细胞毒性（尤其是CGs的减少）等指标做出综合评价。

2．液体闪烁计数法根据液体闪烁计数测量数据，计算出各样本中³H/¹⁴ C的放射活性比，后者为单位重量DNA中³H-TdR掺入水平的反映值。令溶剂对照的³H/¹⁴ C比的均值为1.00(100%)，计算出各样本对照的变化量，并由此计算出各试验点的有关统计量。以受试样品剂量为横坐标，相对³H/¹⁴ C放射活性比为纵坐标，绘制剂量一反应（效应）关系图。并按t检验统计分析受试样品组与溶剂对照组均值间的差异程度。

UDS试验作为致癌性化合物的快速预试验，从一个以评价各短期试验价值的国际协作程序的报告中可以看出是一个较好的测试系统。如以液体闪烁计数技术和以HeLa细胞为靶细胞的试验系统对42种编码化合物的测试结果，致癌性化合物检出的灵敏度为0.68、特异性为0.706、正确性为0.691( Martin 1981)。而不同实验室用鼠伤寒沙门菌／微粒体酶系对这些编码化合物的测试结果，灵敏度在0.417～0.680、特异性在0.588～0.824、正确性在0.538～0.690。若将两项试验结合进行，对致癌性化合物检出的灵敏度、特异性和正确性分别可达0.84,0.82及0.833。

【注意事项】

1．放射自显影处理的全过程需在暗室中于红灯下或在暗盒中进行，在定影结束前应尽量少用红灯而在全暗条件下处理为宜。

2．对于特别大或特别小的核以及人为现象造成的细胞显影不计数。