一、实验目的

    掌握用荧光分光光度法测定茶叶中硒含量的原理与方法。

    二、实验原理

    茶叶样品经H₂SO₄一HClO₄混合酸消化后，硒被氧化为四价无机硒(Se)，与2，3二氨基萘(2，3一diaminonaphthalene，DAN)反应生成4，5一苯并苤硒脑(4，5一benzo piaselenol)。该物质在376nm激发波长下，能产生绿色荧光，荧光强度与硒的浓度在一定范围内成正比。以环己烷萃取该物质，并于激发光波长376nm、发射光波长520nm处测定荧光强度，通过与硒的标准曲线比较，可以实现定量分析。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

    荧光分光光度计、沙浴装置、不锈钢磨、水浴锅、干燥箱等。

    2．试剂

    除特别注明外，实验所用试剂均为分析纯，水为去离子水。

    (1)常规试剂：H₂SO₄、环己烷(C₆H₁₂)、HNO₃、HClO₄、HCl、氢溴酸(HBr)、NH₃·H₂0、EDTA、NH₂0H·HCl、甲酚红、2，3一二氨基萘(DAN，纯度95％～98％)、Se(光谱纯)。  

    (2)常规溶液：NH₃·H₂0溶液(1+1，体积比)、HCl溶液(1+9，体积比；O.1mol／L)、EDTA溶液(0.2 mol／L)、NH₂0H·HCl溶液(10％，质量体积浓度)、H₂SO₄一HClO₄混合酸(2+1，体积比)。

    (3)去硒H₂SO₄溶液(5+95，体积比)：取200mL H₂SO₄，加于200mL水中，再加30ml HBr，混匀，置沙浴上加热，蒸去硒与水分，至出现浓白烟，即为去硒 H₂SO₄，此时体积应为200ml。取5mL该H₂SO₄，稀释于95mL水中。

    (4)甲酚红指示剂(O．02％)：称取50mg甲酚红溶于水中，加氨水溶液1滴，待甲酚红完

全溶解后，加水稀释至250mL。

    (5)EDTA混合液：取EDTA溶液与NH₂0H·HCl溶液各50mL，混匀，再加5mL甲酚红指示剂，用水稀释至1000mL。

    (6)2，3二氨基萘(DAN)溶液(O．1％)：取200mg DAN于一带盖锥形瓶中，加入200mL HCl溶液(O.1mol／L)，振摇约15min，使其全部溶解。加约40mL环己烷，继续振摇5min，将此液转入分液漏斗中，待溶液分层后，弃去环己烷层，收集DAN层溶液。如此用环己烷纯化DAN直至环己烷中的荧光数值降至最低时为止(纯化次数视DAN纯度不同而定，一般需纯化3～4次)。将提纯后的DAN溶液储于棕色瓶中，加约1cm厚的环己烷覆盖于溶液表面。置4℃下保存，必要时可再纯化一次。注意：配制过程需在暗室中进行。

    (7)硒标准储备液(100 μg／mL)：称取100.0mg元素硒，溶于少量HNO₃中，加2mL HClO₄，置沸水浴中加热3～4h，冷却后加入8．4mL HCl，再置沸水浴中煮2min，冷却后移入1000mL。容量瓶中，以HCl溶液(O．1mol／L)定容至刻度。

    (8)硒标准使用液(O．05μg／mL)：以HCl溶液(O．1mol／L)稀释硒标准储备液至硒浓度为

0．05μg／mL，于4℃下保存。

    3．实验材料

    2～3种绿茶、红茶和花茶，各50g。

    四、实验步骤

    1．样品消化

    (1)将茶叶样品用水洗三次，60℃烘干至恒重，用不锈钢磨粉碎，过60目筛，备用。

    (2)称取0.5～2.Og茶叶(根据样品中硒的估计含量决定样品用量，使硒含量为0.01～0.5μg)于磨口锥形瓶内。

    (3)加10mL去硒HzS0。溶液，湿润样品后，加20mI。H。sO。一HCl0．混合酸，放置过夜。

    (4)于沙浴上逐渐加热，当消化至溶液变无色时，继续加热至产生白烟，溶液逐渐变成淡

黄色。

    (5)取与样品处理相同的混合酸和去硒H₂SO₄溶液，按同一操作方法做试剂空白试验。

    2．样品测定

    (1)准确吸取硒标准使用液O、O.2mL、1.OmL、2.0mL及4.0mL(相当于0、0.01μg、O.05μg、0.1μg、O.2μg硒)，加水至5mL。

    (2)于样品消化液、空白试剂液和硒系列标准液中，加20mL EDTA混合液，以NH₃·H₂O溶液或HCl溶液(0．1mol／L)调至淡红橙色(pH 1．5～2．O)。

    (3)于暗室中，加3mL DAN溶液，混匀，置沸水浴中煮5min，冷却后，加3mL环己烷，振摇4min，将全部溶液移入分液漏斗。

    (4)待分层后弃水层，环己烷层转入带盖试管中，小心勿使环己烷中混入水滴。

    (5)以荧光分光光度计于激发光波长376nm、发射光波长520nm处测定荧光强度。

    (6)以硒的含量为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，并从曲线上查出样品液与空白试剂液中硒的含量。

    3．计算

    按下式计算样品中硒的含量：

    x=(m₁—m₀)/m

    式中，x为样品中硒的含量，μg／g；m₁为样品液中硒的质量，μg；m₀为空白试剂液中硒的

质量，μg；m为样品的质量，g。

    五、注意事项

    硒含量在O．5μg以下荧光强度与硒含量呈线性关系，同时本方法的检出限为3ng，所以在测定中一定要注意样品的用量。

    六、思考题

    1．简述硒的生理作用。

    2．为什么配制DAN溶液时需要在暗室中进行?

    3．写出硒与DAN反应生成4，5一苯并苤硒脑的反应式。