一、实验目的

    了解胆碱酯酶抑制法快速测定蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留的原理，掌握农药速测卡的使用方法。

    二、实验原理

    有机磷或氨基甲酸酯农药可以通过共价键与胆碱酯酶(cholinesterase，ChE)活性中心的丝氨酸残基结合，不可逆地抑制ChE酶活性，从而造成动物神经递质聚集，导致神经的传导功能紊乱，出现包括交感神经、副交感神经、运动神经及中枢神经系统方面的毒效应。这是有机磷及氨基甲酸酯农药杀虫和危害其他动物(包括人)的机理。ChE可催化红色的2，6一二氯靛酚乙酸酯水解成为蓝色的2，6-二氯靛酚和乙酸。当ChE的活性被有机磷或氨基甲酸酯农药抑制时，这一反应过程将受到抑制，从而阻止或延缓颜色变化过程，所以依据颜色变化就可以判断出样品中是否含有或含有多少有机磷或氨基甲酸酯农药残留。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

    农残速测仪、蔬菜取样器、剪刀等。

    2．试剂

    除特别注明外，实验中所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。

    (1)常规试剂与溶液：pH=7．5的磷酸缓冲溶液(称取11.9g K₂HPO₄、3.2g KH₂PO₄，溶解定容至1000mL)、速测卡(包括酶片和底物片)。

    (2)甲胺磷农药标准液(50.0μg／mL)：取1.00g 80％甲胺磷乳油于1000mL烧杯中，加入500mL水，搅拌均匀；取该溶液10.0mL于1500mL烧杯中，加入310mL水，搅拌均匀，备用。

    (3)敌敌畏农药标准液(1.0μg／mL)：取1.00g 80％敌敌畏乳油于1000mL烧杯中，加入500mL水，搅拌均匀；取该溶液200μL于500mL烧杯中，加入320mL水，搅拌均匀，备用。

    3．实验材料

    2～3种大白菜，各200g。

    四、实验步骤

    1．样品提取

    (1)以取样器取来自8～10片菜叶样本2.0g，置于50mL锥形瓶中。

    (2)加入10.0mL磷酸缓冲溶液，充分振摇1min，静置备用。

    2．测定

    (1)仪器准备：开启农残速测仪，使温度恒定为40℃。除去速测卡保护膜，对折后，插入速测仪加热槽，使白色的酶片置于加热端，备用。

    (2)分别吸取甲胺磷标准溶液20μL、60μL、100μL和140μL于4只小试管中，再分别加入980μL、940μL、900μL和860μL的磷酸缓冲溶液，振摇混匀，甲胺磷浓度分别为1．0mg／L、3．0mg／L、5．0mg／L和7．0mg／L。

    (3)分别吸取敌敌畏标准溶液10μL、50μL、200μL和400μL于4只小试管中，再分别加入990μL、950μL、800μL和600μL的磷酸缓冲溶液，振摇混匀，敌敌畏浓度分别为0.01mg／L、0.05mg／L、0.2mg／L和0.4mg／L。

    (4)取上述不同浓度的农药标准溶液和样品提取液各70μL于速测卡的酶片上，40℃保温10min后，合上农残速测仪上盖，使红色底物片与酶片重合，反应3min后，观察酶片的颜色变化。同时，用70μL的磷酸缓冲溶液做空白对照。

    3．结果判定

    (1)与空白对照卡比较，白色酶片不变色(仍为白色)或略有浅蓝色均为阳性结果。不变色

(仍为白色)的为强阳性结果，说明农药残留量较高；显浅蓝色的为弱阳性结果，说明农药残留量相对较低。如果白色酶片变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果，说明无有机磷和氨基甲酸酯农药残留，或残留量低于本法检出限。

    (2)分析不同浓度甲胺磷和敌敌畏标准溶液的实验结果，即酶片的显色情况，可以判断速测卡(主要是酶片)是否变质失效。如果对不同浓度的标准品溶液，酶片的显色没有差异，那么表明速测卡已经变质。同时，通过分析不同浓度酶片的显色差异，也可以分析速测卡的检出限。还有，将农药标准溶液的测定结果与样品的测定结果进行比较，可以知道样品中农药残留量相当于多少浓度的标准农药。

    五、注意事项

    1．目前市场上已有多种商品化的酶片法快速检测蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留的试剂盒(箱)，这些产品尽管在形式上有一定的差异，但是它们的核心部件都包括由酶片和底物片组成的速测卡片和供加热保温用的农残速测仪。其中，速测卡片是将底物和酶分别固定在滤纸条上两端一定区域内的滤纸片。

    2．本方法除用于白菜的测定外，也可用于其他蔬菜中有机磷或氨基甲酸酯农药残留的测定，但是葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄的汁液中，由于含有色素和胆碱酯酶抑制物等影响测定结果的物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株(体)蔬菜浸提或采用表面测定法，避免蔬菜破碎后汁液中的物质影响实验结果。

    3．速测卡对农药非常敏感，测定时如果附近刚刚喷洒农药或使用过卫生杀虫剂，以及操作者和器具沾有微量农药，都会造成对照和测定药片不变蓝，所以农药样品要在通风橱中配制，且应远离样品检测地点。

    4．红色底物片与白色酶片叠合反应的时间以3min为准，3min后蓝色会逐渐加深，影响结果判定。

    六、思考题

    1．写出乙酰胆碱酯酶催化2，6-二氯靛酚乙酸酯水解成为蓝色的2，6-二氯靛酚和乙酸的化学反应式。

    2．比较GC、HPLC和各种快速检测方法检测食品(农产品)中有机磷农药残留的优缺点。

    3．如何分析茭白、蘑菇及番茄等蔬菜汁液中影响实验结果的物质?