一、实验目的

    掌握HPLC法检测蜂蜜中的链霉素残留量的原理与方法。

    二、实验原理

    蜂蜜样品中的链霉素残留以磷酸溶液提取，阳离子交换柱和C₁₈固相萃取柱净化，旋转蒸发浓缩后，以庚烷磺酸钠溶液溶解，经高效液相色谱分离、柱后衍生后，通过荧光检测器测定，与标准品比较，实现定性和定量分析。    

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

    高效液相色谱仪(配柱后衍生装置和荧光检测器)、水浴锅、液体混匀器、旋转蒸发器、真

空固相萃取装置、微量进样器等。

    2．试剂

    除特别说明外，实验中所有试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。

    (1)常规试剂：甲醇、乙腈、正己烷、HAc、H3PO4、K2HPO4、KH2PO4、庚烷磺酸钠[CH3(CH2)6SO3·Na]、1，2一萘醌一4一磺酸钠(C10H5NaO5S)、叔丁基甲醚[CH3OC(CH3)3]、苯磺

酸型阳离子交换柱(500mg，3mL)、C18固相萃取柱(500mg，3mL)、玻璃棉(磷酸浸泡，备用)。

    (2)标准品：链霉素(纯度≥95％)。

    (3)常规溶液：H3PO4溶液(O．1％，体积分数，pH一2)、磷酸缓冲溶液(pH=8，0.2mol／L)、NaOH溶液(0．2mol／L)、庚烷磺酸钠溶液(O.5mol／L)、pH-3.3的庚烷磺酸钠溶液(0.01mol／L，以HAc调pH值)、叔丁基甲醚一正己烷混合溶液(4+1，体积比)

    (4)链霉素标准储备溶液(0.40mg／mL)：储存于4℃冰箱中。

    (5)链霉素标准工作溶液：用pH-37.3的庚烷磺酸钠溶液将链霉素标准储备溶液稀释成O、

O.02mL／L、O.04mL／L、O.06mL／L、O.08mL／L、O.1mL／L、O.2mg／L的标准工作溶液。

    3．实验材料

    2～3种蜂蜜，各250g。

    四、实验步骤

    1．样品提取

    (1)对无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌均匀备用；对有结晶的蜂蜜样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，备用。

    (2)取10．00g蜂蜜置于150mL锥形瓶中，加入25mL H3P04溶液，在液体混匀器上高速混合5min，使试样完全溶解，即为样品提取液。

    2．净化    

    (1)将苯磺酸阳离子交换柱先用5mL甲醇和10mL水预洗并保持柱体湿润。

    (2)在真空固相萃取装置上，将样品提取液以1.5mL／min的流速通过苯磺酸阳离子交换柱。

    (3)分别用5mL H3PO4溶液和10mL水淋洗阳离子交换柱，弃去全部淋洗液。

    (4)用30mL磷酸缓冲溶液以1.5mL／min的流速洗脱离子交换柱上的链霉素，收集洗脱液。

    (5)在洗脱液中加入3mL庚烷磺酸钠溶液，摇匀，再用磷酸调节pH至2，备用。

    (6)在真空固相萃取装置上，将洗脱液以1.5mL／min的流速，通过C₁₈固相萃取柱(以5mL甲醇和10mL水预洗并保持柱体湿润)。

    (7)用5mL H3PO4溶液淋洗C18固相萃取柱，在真空泵65kPa负压情况下，减压抽干5min。

    (8)以4mL叔丁基甲醚一正己烷混合溶液淋洗C18固相萃取柱，再减压抽干5min，弃去全部

淋出液。以10mL甲醇以1．5mL／min的流速通过C18固相萃取柱，洗脱链霉素。

    (9)收集洗脱液，于旋转蒸发器45℃水浴中减压蒸发至干。以1.0 mL庚烷磺酸钠溶液溶解

残渣，供液相色谱测定。

    3．测定  

    (1)分别取80μL标准工作溶液和样品溶液，上样至HPLC仪，以色谱峰高对标准溶液中组

分的绝对量绘制标准曲线，求出样品提取液中链霉素的含量。

    (2)参考色谱条件：色谱柱为Hypersil C₁₈柱(150mm×4．6mm，5μm)；流动相为将1.10g

庚烷磺酸钠、O.052g 1，2萘醌-4-磺酸钠溶于500mL乙腈-水溶液(27+73，体积比)中，以HAc

调节pH至3.3；流动相流速为1．0mL／min；检测器波长，激发波长为263nm，发射波长为435nm；色谱柱温度为50℃；衍生管为10m×O.25mm(内径)不锈钢衍生管，衍生剂为NaOH溶液，衍生管温度为50℃，衍生剂流速为O.4mL／min；进样量为80μL。

    4．计算

    按下式计算样品中链霉素的含量：

    x=cV/m

    式中，x为样品中链霉素的残留含量，mg／kg；c为样品净化液中链霉素的浓度，μg／mL；V为样品溶液的最终定容体积，mL；m为净化液代表样品的质量，g。

    五、注意事项

    1．实验步骤中的色谱条件仅供参考，在实验中应根据仪器的型号和实验条件，通过预备实验来确定最佳的色谱条件。

    2．在本实验色谱条件下，链霉素的保留时间约为9min，也可以通过调整洗脱液中乙腈的比例，来控制链霉素的出峰时间。    

    3．本实验方法链霉素的检出限为O.010mg／kg。

    六、思考题

    1．试比较HPLC分析中，柱前衍生与柱后衍生的优缺点。

    2．试分析流动相中庚烷磺酸铡和1，2一萘醌一4一磺酸钠的作用。