一、实验目的

    掌握间接竞争ELISA检测牛奶中链霉素残留量的原理与方法。

    二、实验原理

    间接竞争ELISA是ELISA中的一种，在检测过程中，在预先包被有链霉素一蛋白质偶联物的酶标板微孔内，同时加入抗链霉素抗体和标准链霉素溶液(或待测样品的链霉素提取液)，微孔内与蛋白质偶联的链霉素(也称为固定链霉素)与添加的链霉素标准品或样品提取液中的链霉素(也称为游离链霉素)竞争抗链霉素抗体的结合位点。游离链霉素量越多，抗体与固定链霉素结合越少，反之结合越多。待反应达平衡后，洗涤未结合的物质，并加酶标二抗和底物显色，测定吸光度。以链霉素标准溶液中链霉素浓度的对数为横坐标，对应的吸光度和链霉素浓度为零时吸光度的比值的百分数为纵坐标，绘制ELISA竞争抑制曲线。根据样品提取液的吸光度，利用竞争抑制曲线，计算样品中链霉素的含量。

    三、仪器与试材    

    1．仪器与器材

    酶联免疫检测仪、磁力搅拌器、水浴恒温振荡器、离心机、酶标板、移液器等。

    2．试剂

    (1)常规试剂：卵清蛋白一链霉素(OVA—SM)偶联物(包被抗原)、抗链霉素单克隆抗体(anti-SM-BSA-McAb)、羊抗鼠酶标二抗(goat anti-mouse IgG-HRP)、Tween(吐温)-20、邻苯二胺、脱脂奶粉、NaHCO₃、Na₂CO₃、KH₂PO₄、Na₂HPO₄、NaOH、KCl、过氧化氢(H₂O₂)、H₂SO等。

    (2)标准品：链霉素，(纯度≥95％)。

    (3)常规溶液：0.36mol／L K₃[Fe(CN)₆](铁氰化钾)溶液、1.04mol／L ZnSO₄溶液、磷酸盐缓冲液生理盐水(pH=7.2，0.1mol／L，简称PBS)、pH=9.5的0.1mol／L碳酸盐缓冲液(ELISA包被液，简称CBS)、5％的脱脂牛奶(溶于ELISA洗涤液)、pH=5.0的0.1mol／L柠檬酸0.2mol／L Na₂HPO₄缓冲液(底物缓冲溶液)、2mol／L H₂SO₄溶液(ELISA终止液)。

    (4)ELISA洗涤液(简称PBST)：取Na₂HPO₄·12H₂0 2.9g、KH₂PO₄ 0.2g、NaCl 8.Og、KCl 0.2g、Tween-20 0.5mL，溶于1000mL蒸馏水中。

    (5)底物溶液：将4mg邻苯二胺溶于10mL底物缓冲溶液，加入150μL H₂O₂，现配现用。

    3．实验材料

    2～3种新鲜牛奶，各50mL。

    四、实验步骤

    1．样品处理

    (1)取新鲜牛奶5mL，于4℃以5000r／min离心20min，弃去上层脂肪，取下层清液。

    (2)加入0.5mL铁氰化钾溶液，摇匀后再加入0.5mL ZnSO₄溶液，迅速摇匀。

    (3)以5000r／min离心15min，上清液以PBS按1：4稀释，稀释液供ELISA分析。

    2．标准曲线的绘制 

    (1)抗原包被：将100μL包被抗原溶液(OVA-SM溶于CBS中，浓度为10μg／mL)加入96孔酶标板的微孔内，于4℃静置过夜。取出酶标板，恢复至室温，倾去包被液，用PBST满孔洗涤3次，每次5min，扣干。 

    (2)封阻：每孔200μL 5％的脱脂牛奶(溶于PBST)作为封阻液，于37℃保温保湿2h。取出酶标板，倾去封阻液，用PBST满孔洗涤3次，每次5min，扣干。

    (3)竞争抗原抗体反应：每孔加入以PBST适当稀释的抗链霉素单克隆抗体90>L，同时分别加入不同浓度的链霉素标准溶液10肛L，使添加标准溶液的微孔中链霉素反应浓度分别为0、50ng／mL、100ng／mL、200ng／mL、500ng／mL、1000ng／mL，混匀，每个浓度做3个平行；于

37℃保温保湿1h。同样以PBST满孔洗涤3次，扣干。

    (4)酶标二抗反应：每孔加入100μL的羊抗鼠IgG-HRP溶液(酶标二抗，1：1000稀释)，于37％保温保湿1h。以PBST满孔洗涤5次，扣干。

    (5)底物显色：每孔加底物溶液100μL，于37℃保温保湿，避光反应30min。

    (6)吸光度测定：每孔加50μL 2mol／L H2SO4终止反应，5min后，以空白孔调零，测定A _490nm。

    (7)标准曲线的绘制：以链霉素浓度的对数为横坐标，对应的吸光度与链霉素浓度为零时吸光度的比值的百分数为纵坐标，绘制链霉素标准竞争曲线。

    3．样品测定

    (1)除了在“标准曲线的绘制”(3)竞争抗原抗体反应中，以10μL样品提取液替代链霉素

标准品溶液外，其他操作过程同“标准曲线的绘制”的(1)～(6)。

    (2)根据样品提取液的A _490nm值与链霉素浓度为零时吸光度比值的百分数，从标准曲线上查找并计算样品提取液中链霉素的浓度。

    4．计算

    按下式计算样品中链霉素的浓度：

    x=（cV×1000）/m

    式中，x为样品中链霉素的残留含量，ng／kg，c为从标准曲线上查得的样品提取液中链霉素的浓度，ng／mL，V为样品提取液的体积，mL；m为样品的质量，g。

    五、注意事项

    1．实验中的操作条件仅供参考，具体参数应该根据抗原、抗体，特别是抗体的灵敏度和特异性进行调整，也可以采用商品试剂盒进行试验，但必须严格按说明书进行操作。

    2．由于ELISA的灵敏度较高，各步反应体系的体积稍有变化，即可影响实验结果，因此在

所有的加样过程中，溶液应加到微孔底部，避免溅出。

    3．ELISA的主要试剂为具有生物活性的蛋白质，在操作过程中容易产生气泡，由于气泡液膜表面具有较大的表面张力，可能破坏蛋白质的空间结构，进而破坏其生物活性，因此在操作过程中注意应防止气泡的产生。

    六、思考题

    1．简述间接竞争ELISA的原理。

    2．在本实验中，为什么吸光度越低，样品中链霉素含量越高?