一、实验目的

    掌握杯碟法测定肉及其制品中四环素类抗生素残留的原理和方法。

    二、实验原理

    四环素、土霉素、金霉素等四环素类抗生素是目前常用的一类抗生素，在动物疾病的预防和治疗中发挥了重要的作用，但是它们在肉及其制品中的残留也不容忽视。四环素类抗生素对蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)等微生物的生长有很强的抑制作用。将肉及其制品中四环素类抗生素残留的提取液，加入到含有蜡样芽孢杆菌琼脂平板上的牛津杯中，以四环素标准品为对照，通过比较牛津杯周围抑菌圈的大小，可以计算出样品中四环素类抗生素的残留量。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

    生化培养箱、灭菌锅、离心机、恒温水浴锅、均质器、不锈钢牛津杯(内径6mm、外径8mm、高度10mm)、游标卡尺等。

    2．菌种与培养基

    (1)菌种：蜡样芽孢杆菌(B．cereus) ATCC 11778，保存于营养琼脂斜面。

    (2)菌种培养基：胰蛋白胨10.Og、牛肉膏5.0g、NaCl 2.5g、琼脂15.Og、蒸馏水1000mL，调pH=6.5。将以上成分加热溶解后，分装于500mL茄子瓶(每瓶200mL)和试管中，于121℃灭菌15min。用于菌种培养和活化。

    (3)检测培养基：胰蛋白胨6.Og、牛肉膏1.5g、酵母膏3.Og、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL，调pH=5.8。将以上成分加热溶解后，分装于500mL锥形瓶(每瓶200mL)，于121℃灭菌15rain。

    3．试剂与溶液

    (1)常规溶液：磷酸缓冲液(O.1mol／L，pH=4．5)、生理盐水(0．85％NaCl、HCl溶液(O.1mol／L)。

    (2)四环素标准液(50μg／mL)：称取四环素50mg，用1mL HCl溶液溶解，以蒸馏水定容至1000mL，于4℃可保存1周。

    4．实验材料

    新鲜猪肉、牛肉、羊肉以及火腿肠，各250g。    

    四、实验步骤

    1．样品处理

    (1)取样品50g，切碎成1cm³大小的颗粒，混匀。

    (2)称取10.0g样品颗粒，加入20mL磷酸缓冲液，搅匀后放置60min，于均质器中均质1min，以4000r／min离心10min，上清液为样品提取液。

    2．芽孢悬液和平板的制备

    (1)将菌种接种于菌种培养基试管斜面，于30℃培养3d，转接3次，使菌株活化。

    (2)将活化菌种接种于茄子瓶斜面，于30℃培养，镜检。当芽孢数达到85％以上(一般需

要5～7d)时，每个茄子瓶以25mL无菌生理盐水洗涤，收集芽孢悬液。

    (3)芽孢悬液于65℃水浴中保温．30rnin后，以2000r／min离心20min，弃去上清液。芽孢沉淀以无菌生理盐水离心洗涤三次后，以50mL无菌生理盐水制成芽孢悬液，并于65℃水浴中保温30min后，冷却，计数，于4℃可保存1个月。

    (4)将芽孢悬液系列稀释后，以混菌法分别制备检测培养基平板，以O.05μg／L浓度的四环素溶液可产生12mm以上清晰、完整的抑菌圈的芽孢浓度作为芽孢最适用量。依据芽孢最适用量，以混菌法制备测定平板。

    3．标准曲线的绘制    

    (1)取四环素标准液，稀释成0．025μg／mL、O．050μg／mL、O．100μg／mL、O．200μg／mL、O．400μg/mL、O．800μg／mL的标准系列溶液。

    (2)取18个测定平板，分为I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V、Ⅵ共6组，每组3个平板(做重复实验)，在每个平板上用无菌镊子均匀放置6个无菌牛津杯，使之互成60°的角间距。共需要108个牛津杯。

    (3)于第1组每个平板的牛津杯中分别加满(约300μL)标准溶液作为阴性对照组。

    (4)于Ⅱ～Ⅵ组每个平板上的6个牛津杯中，间隔(共3个牛津杯)加满四环素标准液作为参

考浓度。各组余下的牛津杯(每个平板3个)，根据组别顺序依次加满0．050μg／mL、O.100μg／mL、O．200μg／mL、O．400μg／mL、0．800μg／mL的标准溶液。其中0．200μg／mL参考浓度的标准液将得到45个抑菌圈直径的数值，而其他标准液分别得到9个抑菌圈直径的数值。

    (5)置于30℃培养(17±1)h后，以游标卡尺精确测量各个浓度产生的抑菌圈的直径(精确

到O．1mm)，求平均值，再求出O．200μg／mL，参考浓度45个抑菌圈直径的平均值。

    (6)求各组平板的校正值(mm)。校正值等于Ⅱ～Ⅵ组参考浓度(O．200μg／mL)的抑菌圈直径的总平均值与各组平板参考浓度的抑菌圈直径平均值之差。用此校正值分别校正0．050μg／mL、0．100μg／mL、0．200μg／mL、0．400μg／mL、0．800μg／mL标准溶液的抑菌圈直径平均值。

    (7)将校正值用下列公式分别计算出L和H值。在半对数坐标纸上，以抑菌圈直径为横坐标，抗生素浓度对数为纵坐标，通过L和H点连成一直线，即为标准曲线。

    L=(3a＋2b＋c—e)/5    H=(3e＋2d＋c—a)/5 

    式中，L为标准曲线的最低浓度(O.050μg／mL)的抑菌圈直径，mm；H为标准曲线的最高浓度(0.800μg／mL)的抑菌圈直径，mm；a、b、d、e为相应浓度分别为O.050μg／mL、O.100μg/mL、0.400μg／mL和0.800μg／mL的抑菌圈经校正后的平均值，mm；c为参考浓度O.200μg／mL的45个抑菌圈直径的平均值，mm。

    4．样品测定

    (1)每个样品取3个测定平板，均匀放置6个牛津杯，间隔加满0.200μg／mL四环素标准溶液作为参考浓度。在其他牛津杯中加满样品提取液，于30℃培养(17±1)h。

    (2)精确测量产生的抑菌圈直径(精确到0．1mm)。分别求出参考浓度和样品抑菌圈直径数值校正值，从四环素标准曲线上查出样品中抗生素的残留含量。

    5．计算和表述    

    如样品提取液抑菌圈的直径<12mm，即报告为阴性。

    如样品提取液抑菌圈的≥12mm，求出每组3个检定平板上样液和参考浓度标准工作液抑菌圈直径的平均值，经校正后，从标准曲线上查出相应的浓度，通过下式计算样品中四环素类抗生素的残留量。

    x=c/m

    式中，x为样品中四环素类抗生素的残留量，mg／kg；c为从标准曲线上查出的样液中四环素类抗生素的浓度，μg／mL；m为每毫升最终样液所代表的样品质量，g／mL。

    五、注意事项

    1．整个实验过程必须严格进行无菌操作，所用到的器皿(包括培养皿、牛津杯和镊子等)和溶液(生理盐水和磷酸缓冲溶液)在使用前均应该灭菌。必要时也可以对四环素标准溶液进行

膜(孔径0．22μm)过滤除菌。

    2．为了防止溶液从牛津杯中溢出，加完溶液后可放置2～3h，再平稳地移入培养箱中。

    3．由于芽孢浓度可以影响抑菌圈的大小，所以应对芽孢悬液的用量进行分析，一般每lOOmL测定培养基中加入0.5～1.OmL芽孢浓度为10⁶／mL的芽孢悬液比较合适。

    六、思考题

    1．简述四环素类抗生素常见的种类及其特性。

    2．为什么蜡样芽孢杆菌的芽孢浓度可以影响抑菌圈的大小?

    3．除了蜡样芽孢杆菌外，还有什么微生物可以用于食品中四环素类抗生素残留的测定?简述它们的特点。