一、实验目的

    掌握微生物杯碟法测定蜂蜜中四环素类抗生素残留量的原理和方法。

    二、实验原理

    样品中四环素类抗生素经Mcllvaine缓冲液提取、SEP-PAK C_l8住纯化后，素等残留以薄层色谱和生物检测法相结合进行分离和定性，以蜡样芽孢杆菌为实验菌株，采用微生物杯碟法进行定量。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

    生化培养箱、灭菌锅、恒温水浴锅、旋转蒸发器、离心机、展开槽(内长20cm、宽15cm、

高30cm)、长方形培养皿(高×宽×长，1．5cm×8cm×23cm)、色谱用纸(7cm×22cm)、微量

注射器、游标卡尺、不锈钢牛津杯(内径6ram、外径8mm、高度10ram)。

    2．菌种与培养基

    (1)菌种：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus var．mycoides)，菌号63301。

    (2)菌种培养基：胰蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、NaCl 2.5g、琼脂15 .0g、蒸馏水1000mL。将以上成分加热溶解后，调pH为7．2～7．4，分装于茄子瓶与试管中，于121℃灭菌15min。用于菌种培养和活化。

    (3)检测培养基：胰蛋白胨5.0g,牛肉膏3.0g、K₂HPO₄  3.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL。将以上成分加热溶解后，调pH为6.5±0.1，分装于锥形瓶(每瓶200mL)，于121℃灭菌15min。    

    3．试剂与溶液

    (1)常规溶液：HCl溶液(0.01mol／L)、Mcllvaine缓冲液[pH=4，将27.6g Na₂HPO₄·12H₂O、12.9g柠檬酸(C6H8O7·H2O)、37.2g EDTA二钠加水溶解后定容至1000mL、磷酸缓冲液(0.lmol／L，pH=4.5，灭菌后，于4℃保存)、EDTA二钠水溶液(50g／L)、展开剂[正丁醇一乙酸一水(4+1+5，体积比)]。

    (2)Waters SEP—PAK C18柱(或国产PT-C18柱)：使用时，先用10mL CH3OH滤过活化，再用10mL蒸馏水置换，然后用10mL EDTA二钠溶液洗柱。

    (3)抗生素标准溶液(1000μg／mL)：称取四环素、土霉素、金霉素标准品适量(按效价进

行换算)，以HCl溶液溶解并定容。4℃保存，7d内稳定。

    4．实验材料

    2～3种蜂蜜，各100g。

    四、实验步骤

    1．样品提取

    (1)定量分析用样品提取液的制备：称取混匀的蜂蜜10.0g，加入30mL Mcllvaine缓冲液，搅拌均匀溶解后，过滤，滤液以SEP-PAK C18。柱滤过后，以50mL水洗柱，再以10mL甲醇洗脱，洗脱液经40℃减压浓缩蒸干后，以磷酸盐缓冲液溶解并定容至5mL。    

    (2)定性分析用样品提取液的制备：称取蜂蜜5.0g，按步骤(1)处理，甲醇洗脱液经40℃减压浓缩蒸干后，用0.1mL甲醇溶解。

    2．芽孢悬液和平板的准备

    (1)将菌种移种于茄子瓶培养基斜面，于37℃培养5～7d，当芽孢率达85％，以10mL无菌水洗下菌苔，离心、洗涤2次后，以10mL灭菌水恳浮芽孢，于65℃恒温水浴中保温30mi。。芽孢液于室温下放置24h后，再于65℃恒温水浴中保温30min，冷却，4℃保存。

    (2)将芽孢液系列稀释后，定量加入检测培养基中混匀，以0．25μg／mL的四环素标准液检测芽孢的用量。当该浓度四环素标准液产生15mm以上清晰、完整的抑菌圈时，芽孢悬液的浓度为适合浓度。

    (3)将适当稀释后的芽孢液加到55～60C的检测培养基中，混匀后，倒平板，凝固后，在

每个平板(φ9cm)半径2．3cm的圆周上均匀放置6个牛津杯，牛津杯与牛津杯之间成60°角。

    3．定性测定    

    (1)将色谱用纸均匀喷上磷酸缓冲液，于空气中晾干，备用。    

    (2)在距色谱用纸底边2．5cm起始线上，分别滴加10μL 2μg／mL四环素、土霉素及lμg／mL金霉素标准稀释液与定性样品液(各样点内距应大于1em)，将色谱用纸悬挂于盛有展开剂的展开槽中，以上行法展开，待溶剂前沿展至10cm左右处时，将色谱用纸取出，于空气中晾干。

    (3)将晾干的色谱用纸紧贴于事先加有60mL含有实验用菌的检测培养基的长方形培养皿

中，30min后移去色谱用纸，在37℃±1℃培养16h。

    (4)对比样品提取液与标准品溶液抑菌圈的位置，分析样品中所含四环素类抗生素的类。

    4．定量测定

    (1)取标准原液按1：0．8比例，以磷酸缓冲液稀释，使四环素、土霉素系列标准液的浓度为0.16μg／mL、0.21μg／mL、0.26μg／mL、0.32μg／mL～0.40μg／mL、0.50μg／mL，参考浓度为0.25μg／mL；金霉素系列标准液的浓度为0．033μg／mL、0.041μg／mL、0.051μg／mL、0．064μg／mL、0.080μg／mL、0.100,ug／mL，参考浓度为0.050μg／mL。

    (2)以3个检定用平板为一组，每一种抗生素6个标准液浓度需要6组18个平板，3种抗生素共需要54个平板。在每组各个检定用平板的3个间隔牛津杯内注满一种抗生素的标准品参考浓度液，在另3个牛津杯内注满该抗生素的一个标准浓度液，于37℃±1℃培养16h，然后测量参考浓度和标准液浓度的抑菌圈直径，求得各自9个数值的平均值，并计算出各组内标准液浓度与参考浓度抑菌圈直径平均值的差值F，以F值为横坐标，以标准液浓度对数为纵坐标，在半对

数坐标纸上绘制标准曲线。

    (3)同样，取3个检定用平板，在每个平板上 3个问隔的牛津杯内注满0.25μg／mL四环素

参考浓度液(或0．25μg／mL土霉素或0.050μg／mL金霉素，可以根据上述定性结果，确定抗生

素种类)，另3个牛津杯内注满被检样品液，于37℃±1℃培养16h，测量参考浓度和被检样液的

抑菌圈直径，求得各自9个数值的平均值，并计算出各组内标准液浓度与参考浓度抑菌圈直径平均值的差值Ft。

    (4)根据被检试样液与参考浓度抑菌圈直径平均值的差值Ft，从该种抗生素标准曲线上查

出抗生素的浓度c_t(μg／mL)。样品中若同时存在两种以上四环素类抗生素时，除了四环素、金

霉素共存以金霉素表示结果外，其余情况均以土霉素表示结果。试样中四环素类抗生素残留量按下式计算：

    x_i=c_tV/m

    式中，x_i为试样中四环素类抗生素的残留量，mg／kg；c_t为样品提取液中四环素类抗生素的浓度，μg／mL；V为待检测样品提取液的体积，mL；m为样品的质量，g。

    五、注意事项

    1．整个实验过程必须严格进行无菌操作，必要时抗生素标准溶液也可以进行膜(0.22μm)过滤除菌。

    2．蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus var．mycoides) 63301，可从中国药品生物制品检定所

购买。

    3．在定性测定中，从展开槽中取出的色谱用纸一定要使展开剂挥发干净(可以用电吹风机

的冷风加速展开剂的挥发)，否则将可能影响随后进行的抑菌实验结果。

    4．为了防止溶液从牛津杯中溢出，加完溶液放置2～3h后，再平稳地移入培养箱中。也可以在牛津杯中加入定量的比牛津杯容积稍小体积的溶液，这样就可以避免牛津杯中溶液的溢出。

    5．由于芽孢浓度可以影响抑菌圈的大小，所以应对芽孢悬液的用量进行分析，一般每100mL测定培养基中加入0.5～1．0mL芽孢浓度为10⁶／mL的芽孢悬液比较合适。

    6．在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10％，否则应该重做实验。    

    六、思考题

    1．在提取过程中，定性用样品提取液和定量用样品提取液为什么不同?如果现在只有定性

用样液，那么能否用该样液直接进行定量分析，为什么?如果一定要用该溶液进行定量分析，应该如何处理?