一、实验目的

    掌握采用高效液相色谱测定禽肉中土霉素、四环素和金霉素残留的原理与方法。

    二、实验原理

    土霉素、四环素和金霉素是常见的四环素类抗生素，在预防和治疗畜禽疾病中被广泛使用，在动物肌肉、蛋、奶、脏器组织中的残留比较常见。HPLC是分析畜禽肉中四环素类抗生素残留的主要方法之一。畜禽样品中的抗生素残留经提取、微孔滤膜过滤后，进入高效液相色谱仪，经过色谱柱分离，紫外检测器检测，并与标准品比较可实现定性和定量分析。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

    高效液相色谱仪(附带紫外检测器)、组织捣碎机、振荡器、离心机等。

    2．试剂

    除特别说明外，实验中所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。

    (1)常规试剂与溶液：乙腈(色谱纯)、HClO4溶液(5％)、NaH2PO4溶液(0.01mol／L，以30％HNO3溶液调pH至2.5，0.45μm膜过滤)、HCl溶液(0.1mol／L、0.01mol／L)。

    (2)标准溶液：1 mg／mL土霉素标准溶液(用0.1mol／L HCl溶液溶解并定容)、1mg／mL四环素标准溶液(用0.01mol／L HCl溶液溶解并定容)、lmg／mL金霉素标准溶液(用蒸馏水溶解并定容)。于4℃保存，1周内稳定。

    (3)标准混合溶液：取1.00mL土霉素和四环素标准溶液、2.00mL金霉素标准溶液，置于10mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，得到抗生素标准混合溶液。此溶液每毫升含土霉素、四环素均为0.1mg、金霉素0.2mg。

    3．实验材料

    新鲜猪肉、牛肉、鸡肉和鸭肉，各250g。

    四、实验步骤    

    1．样品提取

    (1)取100．00g样品，割除脂肪和筋骨后，切碎成lcm3左右的小颗粒，然后以组织捣碎机捣碎。

    (2)称取5.00g捣碎样品，置于50mL锥形瓶中，加入25.0mL HCl03溶液，于振荡器上振荡10min，以2000r／min离心3min，取上清液，以0.45μm膜过滤，收集滤液，备用。

    2．标准曲线的绘制

    (1)取标准混合溶液0、25μL、50μL、100μL、150μL、200μL、250μL(含土霉素、四环素

各为0、2.5μg、5.0μg、10.0μg、15.0μg、20.0μg、25.0μg，含金霉素0、5.0μg、10.0μg、20.0μg、30.0μg、40.0μg、50.0μg，分别加水定容至250μL，混匀后，取10肚L进样HPLC仪分析。

    (2)以抗生素含量为横坐标，峰高为纵坐标，绘制标准曲线。

    (3)参考色谱条件：色谱柱为ODS C18柱(6．2mm×15cm，45μm)；柱温为室温；流动相为乙腈-NaH2PO4溶液(35+65，体积比)，流速为1.0mL／min；进样量为10μL；紫外检测器，检测波长为355nm，灵敏度为0．002AUFS。

    3．样品测定

    (1)取样品提取液10μL于上述色谱条件下进行分析。

    (2)根据保留时间对抗生素残留定性，并依据色谱峰高值从标准曲线上查出样品提取液中抗生素的含量。

    4．计算

    根据下式计算样品中抗生素的残留含量：

    x=m₀/m

    式中，z为样品中抗生素的残留含量，mg／kg；m0为样品提取液中抗生素的质量，μg；m为样品的质量，g。

    五、注意事项

    1．在本实验条件下，HPLC对畜禽肉中土霉素、四环素和金霉素残留量的最低检出浓度分

别为0.15mg／kg、0.20mg／kg和0.65mg／kg。

    2．实验步骤中的色谱条件仅供参考，在实际的测定过程中，应根据仪器的型号和实验条件，依据说明书，通过预备实验进行确定。

    六、思考题    

    1．论述色谱分析条件对分析结果的影响。

    2．在绘制标准曲线时，常常需要在标准品溶液中添加无抗生素的样品提取液，为什么?