一、实验目的

    掌握采用HPLC法检测蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素等四环素类抗生素残留的原理与方法。

    二、实验原理

    样品中四环素类抗生素残留以Na2EDTA—Mcllvaine缓冲溶液提取，经Oasis HLB固相萃取柱和阴离子交换柱净化后，以高效液相色谱分离，紫外检测器检测，与标准品比较实现定性和定量分析。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

    高效液相色谱仪(配有紫外检测器)、液体混匀器、固相萃取真空装置、pH计等。

    2．试剂    

    除特别说明外，实验中所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。    

    (1)常规试剂：甲醇、乙腈、乙酸乙酯、Na₂HPO₄、柠檬酸、Na₂EDTA、草酸。

    (2)常规溶液：Na2HPO4溶液(O．2mol／L)、柠檬酸溶液(0．1mol／L)、Mcllvaine缓冲溶液(将1000mL柠檬酸溶液与625mL Na。HPO。溶液混合，pH=4.O)、Na。EDTA Mcllvaine缓冲溶液(将60．5g Na。EDTA加入625mL Mcllvaine缓冲溶液中，溶解，摇匀)、甲醇水溶液(1+19，体积比)。

    (3)净化柱：Oasis HLB固相萃取柱(500mg，6mL，使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润)、阴离子交换柱(羧酸型，500mg，3mL，使用前用5mL乙酸乙酯预处理，保持柱体湿润)。

    (4)标准溶液：称取适量的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质(纯度≥95％)，分别用甲醇配制0．1mg／mL的标准储备液，于-18℃储存。根据需要，以流动相逐级稀释成适当浓度的混合标准工作溶液，4℃保存，3d内稳定。

    3．实验材料

    2～3种蜂蜜，各50g。

    四、实验步骤    

    1．样品提取

    称取6．00g充分混匀的蜂蜜样品，于150mL锥形瓶中，加入30mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲

溶液，于液体混匀器上快速混合lmin，使试样完全溶解后，以3000r／min离心5min o上清液用

于净化。

    2．样品净化

    (1)上清液以小于等于3mL／min的流速通过Oasis HLB固相萃取柱后，以5mL甲醇水溶液洗涤，弃全部流出液，并在65kPa的负压下减压抽干20min。

    (2)以15mL 乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液。

    (3)将洗脱液以小于等于3mL／min的流速完全通过阴离子交换柱后，以5mL甲醇洗柱，并在65kPa负压下抽干5min。

    (4)以4mL流动相洗脱，收集洗脱液于5mL样品管中，定容至4mL，供液相色谱仪测定。

    3．测定

    (1)根据样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素含量的情况，选定峰高相近的标准工作溶液。控制标准工作溶液和样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值在仪器测定线性范围内。

    (2)参考色谱条件：色谱柱为μBondapak C18柱(10pm，300mm × 3.9mm)或相当者；流动相为乙腈-甲醇-0.01mol／L草酸溶液(20+10+70，体积比)，流速为1．5mL／min；柱温为25℃检测波长为350nm；进样量为100μL。

    (3)同时进行平行试验和空白试验(除不称取试样外，均按上述步骤进行)。

    4．计算

    根据下式计算待测样品中被测组分的含量：

    x=hc_sV/h_sm

    式中，x为试样中被测组分的残留量，mg／kg；h为样品溶液中被测组分的峰高，mm；c_s为标准工作溶液中被测组分的浓度，μg／mL；V为样品溶液的定容体积，mL；h_s为标准工作溶液中被测组分的峰高，mm，m为所称样品的质量，g。

    五、注意事项

    1.实验步骤中的色谱条件仅供参考，在实际的测定过程中，应根据仪器的型号和实验条件，依据说明书，通过预备实验确定。

    2.在本实验的参考色谱条件下，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的保留时问分别是4.0min、4.8min、9.6min、14.0min。

    六、思考题

    1.在HPLC分析中，各组分的保留时间与哪些因素有关?

    2.试比较四环素类抗生素残留的不同测定方法的优缺点。