一、实验目的

    掌握GC—MS检测蜂蜜中氯霉素残留量的原理和方法。

    二、实验原理

    蜂蜜样品用水溶解后，用乙酸乙酯提取样品中残留的氯霉素，提取液浓缩后再用水溶解，经Oasis HLB固相萃取柱净化并硅烷化后，以GC—MS仪测定，外标法定量。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

    气相色谱质谱仪(配有化学源)、固相萃取装置、自动浓缩仪、氮气吹干仪、振荡器、液体

混匀器、真空泵(真空度应达到80kPa)、离心机等。

    2．试剂

    除特别注明外，实验中所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。

    (1)常规试剂与溶液：甲醇、吡啶、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、六甲基二硅氮烷、三甲基氯硅烷、乙腈水溶液(1+7，体积比)。

    (2)Oasis  HLB固相萃取柱(60mg，3mL)：使用前分别用3mL甲醇和5mL水预处理，保持柱体湿润。    

    (3)硅烷化试剂：将9份吡啶、3份六甲基二硅氮烷和1份三甲基氯硅烷混合。

    (4)氯霉素标准储备溶液(0.1mg／mL)：称取适量的氯霉素标准物质(纯度≥99％)，以甲

醇配制，于4℃储存，可使用两个月。

    (5)氯霉素标准工作溶液：用空白样品提取液将氯霉素标准储备溶液分别配成氯霉素浓度为0．5ng／mL、1．0ng／mL、5．0ng／mL、l0ng／mL、50ng／mL和l00ng／mL的标准工作溶液，于4℃保存，可使用1周。    

    3．买验材料

    2～3种蜂蜜，各l00g。

    四、实验步骤

    1．样品提取

    (1)取5.00g蜂蜜样品，置于50mL具塞离心管中，加入5mL水，于液体混匀器上快速混合lmin，使蜂蜜完全溶解。

    (2)加入15mL乙酸乙酯，在振荡器上振荡l0min，以3000r／min离心10min，吸取上层乙酸乙酯12mL，转入自动浓缩仪的蒸发管中，用自动浓缩仪在55℃减压蒸干，加入5mL水溶解残渣，得样品提取液。

    2．样品净化

    (1)将样品提取液以小于等于3mL／min的流速通过Oasis HLB固相萃取柱，待溶液完全流出后，用l0mL水分两次洗蒸发管和储液器并过柱，再用5mL，乙腈一水溶液洗柱，弃去全部淋出液，在65kPa的负压下减压抽干5min。

    (2)再以5mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液于l0mL刻度离心管中。于50℃用氮气吹干仪吹干，待硅烷化。

    3．硅烷化处理

    加50μL硅烷化试剂于上述净化样品中，混合0.5~lmin，立即用正己烷定容至lmL。

    4．测定

    (1)将氯霉素标准工作溶液硅烷化处理后，于GC—MS仪上分析，以m／z 466为定量离子，以工作溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。

    (2)同时，对样品净化液进行分析，并根据标准曲线查出样品净化液中氯霉素的浓度。

    (3)参考气相色谱一质谱条件：色谱柱为DB一5MS石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；载气为氮气，纯度≥99．999％；流速为1.0mL／min；柱温，初始温度为70℃，然后以25℃／min程序升温至250℃，保持5min；进样量为lμL；进样方式为无分流进样；进样口温度为280℃；接口温度为280℃；负化学源为150eV；离子源温度为150℃；反应气为甲烷，纯度≥9．99％；反应气流量为40％。

    (4)平行试验和空白试验(除不称取试样外，均按上述步骤进行)。

    5．计算

    按下式计算样品中氯霉素的残留量：

     x=cV/m

    式中，x为样品中氯霉素的残留量，μg／kg；c为样品净化液中氯霉素的浓度，ng／mL；V为样品净化液的定容体积，mL；优为样品净化液所代表样品的质量，g。

    五、注意事项

    1．计算结果应扣除空白值。

    2．在用标准工作曲线对样品进行定量时，样品溶液中氯霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内，否则应对样品溶液进行稀释或浓缩。

    3．实验步骤中的色谱一质谱条件仅供参考，实际分析过程中应根据仪器的型号和实验条件，依据说明书，通过预备实验进行调整。

    4．在本实验的参考色谱条件下，氯霉素衍生物的保留时间为12．31min。

    六、思考题

    1．叙述你在实验中使用的GC—MS联用仪的型号、各部件的名称与功能。

    2．比较不同食品中氯霉素的提取净化方法。