一、实验目的

    掌握肉制品中胭脂红含量的HPI。C定性和定量测定方法。

    二、实验原理

    样品经脱脂、碱性溶液提取、蛋白质沉淀、聚酰胺粉吸附与洗脱后，以高效液相色谱仪测定。根据保留时间定性，外标法定量。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

高效液相色谱仪(配有紫外检测器或二极管阵列检测器)、电吹风机、水浴锅、G3砂芯漏斗等。    

    2．试剂

    除特别说明外，实验中所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。

    (1)常规试剂：HCl、NaOH、H2SO4、氨水、甲醇(色谱纯)、甲酸、石油醚(沸程为30～

 60℃)、无水乙醇、钨酸钠、柠檬酸、NH4Ac、聚酰胺粉(过200目筛)。

    (2)常规溶液：HCL溶液(1+10，体积比)、NaOH溶液(50g/L)、H2SO4溶液(1+9，体

 积比)、钨酸钠溶液(100g／L)、NH4Ac溶液(0.02mo1／L，经0.45μm滤膜过滤)、柠檬酸溶液(200g／L)、甲醇一甲酸混合液(3+2，体积比)、无水乙醇一氨水一水溶液(7+2+1，体积比)、pH=5的水(取100mL水，用柠檬酸溶液调pH至5)。

(3)海砂：先用HCl溶液煮沸15min，用水洗至中性，再用NaOH溶液煮15min，用水洗至中性，于105℃干燥，储于具塞瓶中。

    (4)胭脂红标准储备液(1mg／mL)：取按其纯度折算为1()()％质量的胭脂红标准品(含量≥95％)0.100g，置于100mL容量瓶中，以pH=5的水溶解并稀释至刻度。

    (5)胭脂红标准工作液：临用时，将胭脂红标准储备液用水稀释至所需浓度，经0.45μm滤膜过滤后，备用。

     3．实验材料

     2～3种火腿肠，各100g。

    四、实验步骤

    1．样品提取

   (1)称取去除肠衣、切碎的火腿肠10.0g于研钵中，加少许海砂捣碎，研磨混匀，以电吹风

的冷风使试样略微干燥。

   (2)以50mL石油醚提取脂肪，共提取3次，每次提取45min，过滤，去滤液，残渣于通风橱中用吹风机吹干。

   (3)残渣以50mL左右的无水乙醇氨水一水溶液多次反复提取至提取液无色，以砂芯漏斗抽

滤提取液。收集全部提取液于250mL锥形瓶中。

   (4)于70℃水浴上浓缩提取液至10mL以下后，依次加人1.0mL H2SO4溶液和1.0mL，钨酸钠溶液，混匀，继续在70℃水浴中加热5min，沉淀蛋白质。冷却至室温后，以滤纸过滤，用少量水洗涤，收集滤液作为样品提取液。

     2.样品纯化

    (1)将上述样品提取液加热至70℃，将1.5g聚酰胺粉加少量水调成粥状后，倒入样品提取液中，使色素完全被吸附。

    (2)将吸附色素的聚酰胺粉全部转移到布氏漏斗中，抽滤，用70℃柠檬酸溶液洗涤3～5次，然后用甲醇一甲酸混合液洗涤5次，至洗出液无色为止，再用水洗至流出液呈中性后抽干。为了提高洗涤效果，在洗涤过程中应不断搅拌。    、

    (3)用无水乙醇一氨水一水溶液洗涤聚酰胺粉3～5次，每次5mL，收集洗涤液，于70℃蒸发至近干，加水溶解并定容至10mL，过0.45μm滤膜，滤液为样品净化液。

     3.测定

    (1)分别将待测样品净化液和标准工作液用高效液相色谱仪测定，根据保留时间定性；根据试样溶液中胭脂红的含量情况，选定峰面积相近的标准工作液，以外标法定量。

    (2)参考色谱条件：色谱柱为C18柱[150mm×6mm，(内径)，5"m]；流动相为甲醇和O．02mol／L NH4Ac溶液，梯度洗脱，流速为1.0mL／min；柱温为30℃；检测波长为508nm；进样量为20μL。   

    4.计算

    按下式计算试样中胭脂红着色剂的含量：

                                   X=cAV/Asm

    式中，x为样品中胭脂红的含量，mg／kg；c为标准工作液中胭脂红的浓度，μg／mL；A为样品净化液中胭脂红的峰面积；V为样品净化液的体积，mL；As为标准工作液中胭脂红的峰面积；m为样品净化液相当于样品的质量，g。

    五、注意事项

    1.实验步骤中的色谱条件仅作参考，在实际的实验中，应根据仪器类型和实验条件进行调整。

    2.在本实验的参考色谱条件下，胭脂红的保留时间为9.35min。

   六、思考题

   1.简述胭脂红着色剂的化学性质。

   2.如果肉制品中同时存在红曲色素与胭脂红，如何分别测定它们的含量?

  【中国标准物质网】