一、实验目的。

掌握酶联免疫吸附法(ELISA)测定动物性食品中盐酸克仑特罗残留的原理与方法。

二、实验原理

本实验采用直接竞争ELISA方法测定样品中盐酸克仑特罗残留的含量。样品中盐酸克仑特罗残留提取后，在包被有抗盐酸克仑特岁抗体的酶标板微孔内，同时加入盐酸克仑特罗标准液(或样品提取液)与酶(氧化物酶)标盐酸克仑特罗，盐酸克仑特罗与酶标盐酸克仑特罗竞争抗盐酸克仑特罗抗体的结合位点。微孔内游离的盐酸克仑特罗与酶标盐酸克仑特罗被洗涤去除后，结合于微孔内的酶标盐酸克仑特罗的氧化物酶催化无色底物(过氧化尿素和四甲基联苯胺)产生蓝色的产物，并在反应终止液的作用下转化成在450nm处有吸收峰的黄色溶液。在一定的浓度范围内，A450nm与盐酸克仑特罗浓度的自然对数成反比，根据标准曲线可进行定量分析。

三、仪器与试材．

1．仪器与器材

超声波清洗器、pH计、离心机、振荡器、旋转蒸发器、N。一蒸发器、酶标仪(配备450nm滤光片)等。

2．试剂

除特别说明外，实验所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。

(1)常规试剂：：Na2HPO4、NaH2PO4、NaC1、HClO4、NaOH、异丙醇、乙酸乙酯。

(2)常规溶液：HClO4溶液(0．1mol／L20mol／L)、NaOH溶液(1mol／L)、磷酸缓冲液(0．1mol／L，pH一6．0)、异丙醇乙酸乙酯(2+3，体积比)。

(3)盐酸克仑特罗ELISA试剂盒，一般包括以下组分：包被有抗盐酸克仑特罗LgG抗体的96孔酶标板、盐酸克仑特罗系列标准液、氧化物酶标记的盐酸克仑特罗、过氧化尿素、四甲基联苯胺、反应停止液(1mol／LH2SO4溶液)、各种缓冲溶液等。

3．实验材料

2～3种不同动物肝脏，各50g。

四、实验步骤’

1．样品提取

(1)称取样品10．00g，以HClO4溶液(20mol／L)匀浆后，置于磨口玻璃离心管中，再置于超声波清洗器中超声20min，于80℃水浴中加热30min，取出冷却，离心(4500r／min)15min，保留上清液，沉淀以5mLHClO4溶液(0．1mol／L)洗涤，离心，合并上清液。

(2)以Na()H溶液调节上清液pH值至9．5±0．1，若有沉淀产生，再离心10min。

(3)将上清液转移至磨口玻璃离心管中，加入8gNaCl，混匀，加入25mL异丙醇一乙酸乙酯，置于振荡器上振荡提取20min后，放置5min(若有乳化层，再离心)。

(4)用吸管小心将上层有机相移至旋转蒸发瓶中，以20mL异丙醇乙酸乙酯再萃取1次，合并有机萃取液后，于60℃旋转蒸发浓缩至近干。

(5)以3mL磷酸缓冲液分三次溶解洗涤残留物，以0．4μm微孔滤膜过滤，滤液置于5mL比色管中，并以磷酸缓冲液定容至刻度。每毫升溶液相当于2g样品。

2．测定

(1)试剂的准备：根据试剂盒使用说明书的要求和待测样品的数量，取出适量抗盐酸克仑特罗酶标板、盐酸克仑特罗系列标准液、盐酸克仑特罗酶标物、酶反应底物、反应终止液和各种缓冲溶液等，经适当稀释处理后备用。

(2)测定

①将20μL盐酸克仑特罗系列标准液和样品提取液分别加入酶标板的微孔内，同时在各孔内加入1μL稀释的酶标记物，轻轻振荡混匀后，保温1h。每个浓度做3个重复。

②倒出孔中的液体后，将微孔板倒置于吸水纸上拍打3～5次，除去微孔内全部液体后，每孔加入250μL洗涤液，洗涤拍干3～5次。

③每孔加入100μL酶反应底物溶液，避光保温15min后，加入100μL反应终止液，混匀后于450nm波长处测定吸光度。

3．计算

(1)以下式计算标准溶液和样品提取液的相对吸光度(％)。

相对吸光度=（B/B0）×100

式中，B为标准品(或试样)溶液的A450nm；B0为空白(浓度为“0”的标准品溶液)

的A450nm

(2)以相对吸光度对标准品盐酸克仑特岁浓度的自然对数作半对数坐标图。根据样品的相对吸光度从曲线上查出盐酸克仑特罗的残留量，按下式计算样品中盐酸克仑特罗的含量。

X=Af/m式中，X为试样中盐酸克仑特罗的含量，μg／kg；A为从标准曲线查得的样品提取液中盐酸克仑特罗的质量，ng；-厂为试样稀释倍数；m为试样的取样量，g。．

五、注意事项

1．关于实验步骤中测定方法的相关参数，仅供参考，具体的参数应该根据试剂盒说明书的具体要求进行调整。

2．ELISA试剂盒属于生物试剂的范畴，各种试剂应保存在2～8℃的条件下，用多少取多少，取完后应立即置于冷藏条件下，否则将可能严重影响测定结果。