一、实验目的

掌握HPLC测定鲜活水产品中孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿含量的原理和方法。

二、实验原理

孔雀石绿为一种三苯甲烷类分子，当孔雀石绿进入机体14h后，约80％的孔雀石绿代谢为无色孔雀石绿，所以在测定水产品中孔雀石绿的同时，更需要测定无色孔雀石绿的残留。

试样中残留的孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿，以乙腈一乙酸盐缓冲混合液提取、乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，用高效液相色谱一Pb0。柱后衍生法测定，外标法定量。

三、仪器与试材

1．仪器与器材

HPLC仪(配紫外可见光检测器)、固相萃取装置、组织捣碎机、匀浆机、离心机。

2．试剂

除特别说明外，实验所用试剂均为分析纯，水为去离子水或重蒸馏水。

(1)常规试剂与溶液：乙腈(色谱纯)、二氯甲烷、甲醇(色谱纯)、二甘醇、酸性氧化铝

(80～120目)、二氧化铅、硅藻土545(色谱级)、乙酸盐缓冲液(将4．95g无水NaAc与0．95g对甲苯磺酸溶于950mL水中，用冰醋酸调节溶液pH到4．5，定容至1L)、盐酸羟胺溶液(20％)、对甲苯磺酸溶液(1．0mol／I。)、NH。Ac缓冲溶液(50mmol／L，将3．85g无水NH4Ac溶解于1000mL水中，用冰醋酸调pH到4．5)。

(2)孔雀石绿、无色孔雀石绿标准溶液(1μg／mL)：称取适量纯度大于98％的孔雀石绿、隐色孔雀石绿，以乙腈分别配制成100μg／mI。的标准储备液，再用乙腈稀释配制成1“g／mL的标准溶液。于一18℃避光保存。

(3)孔雀石绿、无色孔雀石绿混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液，配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿均为20ng的混合标准工作溶液。于一18℃避光保存。

3．实验材料

3～4种不同种类的鲜活水产品，各500g左右。

四、实验步骤

1．样品提取

(1)称取100g样品于组织捣碎机中捣碎混匀。

(2)取5．00g捣碎样品于50mL离心管中，加入1．5mL盐酸羟胺溶液、2．5mL对甲苯磺酸溶液、5．0mL乙酸盐缓冲溶液，用匀浆机以10000r／min的速度均质30s，加入10mL乙腈剧烈振摇，30s后，再加入5g酸性氧化铝，再振荡30s。

(3)以3000r／min离心10—min后，将上清液转移至装有10mL水和2mL二甘醇的100mL离心管中。

(4)沉淀以10mL乙腈混匀后，以3000r／min离心l0min，将上清转移至另一支装有l0mI．

水和2mL，二甘醇的100mL离心管中。将2支100mL离心管离心后，合并乙腈层于离心管中，作为样品提取液。

2．样品净化

(1)在离心管中加入15mL二氯甲烷，振荡10s，以3000r／min离心10min，将二氯甲烷层转移至100mL的梨形瓶中，再用5mL乙腈、10mL二氯甲烷重复上述操作一次。

(2)合并二氯甲烷层于100mL梨形瓶中，于45℃旋转蒸发至约1mL，以2．5mL乙腈溶解残渣。

(3)将酸性氧化铝柱(1g，使用前用5mL乙腈活化)安装在固相萃取装置上后，将上述梨

形瓶中的乙腈溶液转移到柱上，并以乙腈洗涤瓶两次，每次2．5mL，将洗涤液依次通过柱，控制流速不超过0．6mL／min，收集全部流出液，于45℃旋转蒸发至近干。

(4)用0．5mL乙腈溶解残液，并过0．45μm滤膜，滤液作为样品净化液供液相色谱测定。

3．测定

(1)测定：根据样品净化液中孔雀石绿、无色孔雀石绿的含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。对标准：亡作溶液和样液，按照以下参考色谱条件，等体积参插进样测定。同时，进行空白试验(除不加试样外，均按上述测定步骤进行)。

(2)参考色谱条件：色谱柱为C18柱[250mm×4．6mm(内径)，粒度5μm]，在C18色谱柱和检测器之间连接25％PbO2氧化柱{不锈钢预柱管[5cm×4mm(内径)]，两端附2“m过滤板，抽真空条件下，填装含有25％Pb()。的硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧。临用前以甲醇冲洗}；流动相为乙腈和乙酸铵缓冲溶液，所给参数进行梯度洗脱，流速为1．OmL／rain；柱温为室温；检测波长为618nm；进样量为50μL。

4．计算

样品中孔雀石绿与无色孔雀石绿的残留量按下式计算，并扣除空白值。样品中孔雀石绿的残留量以两者之和表示。

X=cAV/Asm

式中，X为样品中待测组分的残留量，mg／kg；c为待测组分标准工作液的浓度，肚g／mI。；A为样品中待测组分的峰面积；As为待测组分标准工作液的峰面积；V为样液的最终定容体积，mL；m为最终样液所代表的试样量，g。

五、注意事项

1．实验步骤中的色普条件仅供参考，具体条件应根据仪器设备型号和实验室条件进行调整。

2．在本实验条件下，孔雀石绿与无色孔雀石绿的保留时间约为6．10min和17．77min，检测限均为2.0μg／kg。

3．本实验样品中如果同时存在结晶紫及其代谢物无色结晶紫，以本实验的提取液同样可以测定，它们的保留时间分别为7．88min和18．22min，检测限均为2．0μg／kg。