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HPLC与ELISA法测定牛奶中黄曲霉毒素M1的比较研究

发布时间:2014-03-20 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1158

黄曲霉毒素M1(AFM1)是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物,其基本结构为二呋喃环和香豆素[1]。黄曲霉毒素M1(AFM1)是哺乳类动物在摄入被黄曲霉毒素B1污染的饲料和食品后,在体内经过羟化而衍生成的二次毒性代谢产物,存在于动物分泌的乳汁和产生的尿液中。黄曲霉毒素M1的毒性主要表现为致癌、致畸、致基因突变性,与氰化钾和砒霜相比属特别剧毒物质,为强致癌剂,对人体健康危害极大且不被巴氏消毒所破坏[1]。牛奶及其制品是易受到AFM1污染的食品之一。在我国和其它多数国家规定了牛奶及奶制品中AFM1的含量不得超过0.5μg/kg[2–3],而欧盟的要求则更加严格,含量不得超过0.05μg/kg。由于老人和儿童是牛奶消费的重要人群,因此加强对AFTM1的监测,对于保护人类健康十分重要。AFM1是食品检验的常规项目之一,也是牛奶产品中重点监控对象之一。目前,国内外黄曲霉毒素限制正在逐步加强,限量标准也在不断降低,因此需要一种灵敏度高、特异性强、简便快速且易于普及应用的检测方法。AFM1的分析一般采用薄层色谱法(TLC)、酶联吸附免疫法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC)[4]。TLC所需仪器设备简单,具有较好的分离和专一性,在基层比较常用,但存在灵敏度低、试验步骤多、试剂耗费大、干扰因素多、荧光强度的目测准确性比较差等不足,且该法主要是半定量,难以普及;HPLC的灵敏度高、分离能力强、特异性好、测定结果准确可靠,但样品处理繁琐(前处理氮吹蒸发过干会造成AFM1损失)、净化柱消耗较多、检测成本较高等;ELISA方法灵敏度较高,快速、经济,但存在重复性较差、试剂寿命短,需要低温保存等缺点[4–6]。笔者利采用HPLC法和ELISA法同时测定牛奶中AFM1的含量,对两种方法的测定结果及优缺点进行了比较。

1.  实验部分

1.1主要仪器与试剂

高效液相色谱仪:Agilent1200型,附带荧光检测器,美国Agilent仪器公司;酶标仪:MK3型,450nm滤光片,美国Thermo公司;离心机:TDL–5型,四川蜀科仪器有限公司;黄曲霉毒素M1(AFM1)标准品、PriboFast黄曲霉素M1免疫亲和柱:北京泰乐祺科技有限公司;HELICA黄曲霉毒素M1竞争性ELISA检查试剂盒:北京博欧实德生物技术有限公司;甲醇、乙腈:色谱纯,美国TEDIA公司;AFM1标准储备溶液:0.01mg/mL,分别称取标准品黄曲霉毒素M10.10mg(精确至0.01mg),用三氯甲烷溶解并定容至10mL。

1.2实验方法

1.2.1HPLC法

(1)样品前处理。

将100mL牛奶水浴加热至40℃,加入1.0g氯化钠,以4000r/min离心15min;将50mL清澈液注入与免疫亲和柱连接的50mL玻璃注射器中,以2~3mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱,直至2~3mL空气通过柱体,用10mL水洗脱杂质,再用4mL乙腈洗脱AFM1(洗脱时间不少于1min),供HPLC分析。

(2)色谱条件。

色谱柱:ThermoScientificHypersilBDSC18柱(250mm×4.6mm,5μm);流速:1.0mL/min;流动相:乙腈–水(体积比25∶75),流速为1.0mL/min;柱温:30℃;进样量:20μL;激发波长:365nm;发射波长:435nm;外标法定量。

1.2.2ELISA法

将牛奶冷藏过夜,称取2kg离心5min,下层脱脂样品用于检测。向微孔中加入200μL标准品和样品,室温孵育2h后,弃去微孔中内容物,用洗涤缓冲液洗涤微孔,洗涤3次后,轻拍微孔板,弃去残留液。向微孔中加入100μL酶标物,室温孵育15min后,洗涤微孔;向微孔中加入100μL底物试剂,室温孵育15~20min;添加100μL终止液;使用酶标仪在450nm下读取并记录每个微孔的OD值。以标准品的OD值为纵坐标,对应的AFM1浓度的对数值为横坐标,绘制曲线。

2. 结果与讨论

2.1HPLC法工作曲线及检出限

利用AFM1标准储备液配制浓度为1,2,5,10,20ng/mL的系列AFM1标准溶液,在选定的色谱条件下进样分析。以色谱峰面积A对AFM1浓度c(ng/mL)绘制曲线,在1~20ng/mL范围内线性回归方程为A=0.288176c–0.066192,相关系数r=0.9997。对添加低浓度水平的AFM1样品进行测定,以3倍信噪比计算方法的检出限,检出限为0.5μg/kg。AFM1标准样品及样品的色谱图见图1。

2.2ELISA法工作曲线及检出限

利用AFM1标准储备液配制浓度为0.0,5.0,10.0,25.0,50.0,100.0pg/mL的系列AFM1标准溶液,根据1.2.2以浓度的对数(x)为横坐标,以吸光度与空白吸光度之比(y)为纵坐标进行线性回归,得回归方程为y=–7.673x+42.18,相关系数r2=0.9983,线性范围为5.0~100.0pg/mL。对添加低浓度水平的AFM1样品进行测定,以3倍信噪比计算得本方法检出限为0.005μg/kg。

2.3样品检测结果对照

用HPLC法和ELISA法分别对10份牛奶样品进行检测,结果见表1。


由表1可以看出,HPLC法和ELISA法测定结果之间的偏差为0.57~0.89μg/kg;HPLC法测定结果比ELISA法测定结果低,可能由于HPLC法的免疫亲和柱回收率低造成的;10#样品HPLC法未检出,而ELISA法检测结果为0.59μg/kg,可能是牛奶样品中的复杂基质造成的假阳性,也可能是由于ELISA法使用的试剂(抗体和酶)失效而造成的假阳性;两种方法的检测结果同步性较好,即ELISA法测定结果高的样品,HPLC法测定结果也高。除了ELISA法鉴定为假阳性的样品外,HPLC法和ELISA法测定结果的相关性检验值为0.9986,由此可见两种方法之间具有良好的相关性。

由于ELISA法使用的试剂(抗体和酶),牛奶样品基质成分(糖分、脂肪、蛋白质及其其它营养物质)复杂,可能出现少量的假阳性和假阴性结果,故ELISA法可作为测定的初筛方法,适合缺乏大型分析仪器的质检部门应用。

2.4加标回收率和精密度试验

加标回收试验的载体是牛奶,AFM1的本底值未检出。在牛奶样品中加入一定量AFM1标准溶液,使加标最终浓度分别为1,2,5μg/kg,然后进行测定,测定结果见表2。

由表2可知对于已知加标样品(阳性对照),HPLC法的加标回收率为68%~85%,测定结果的相对标准偏差为2.73%~4.55%;ELISA法的加标回收率为97%~109%,测定结果的相对标准偏差为2.18%~4.25%。从表2结果可知,对于已知加标样品,尽管HPLC法加标回收率比ELISA法低,但其精密度比ELISA法高;对于未知样品,HPLC法可以准确地对AFM1定性,ELISA法由于可能出现少量的假阳性和假阴性结果而不可能准确地对AFM1进行定性。

2.5HPLC和ELISA法特点比较

ELISA法比HPLC法样品前处理简单,特异性好,无需纯化浓缩,简便快捷,污染较小,灵敏度较高,适合批量样品的普检和筛选以及缺乏大型仪器设备的基层单位,但可能出现少量的假阳性和假阴性结果;HPLC法需要高效液相色谱仪(荧光检测器),设备投资大,操作技术要求高,免疫亲和柱消耗较多,检测成本高,但无假阳性和假阴性现象。两种方法的特点比较见表3。


3. 结论

(1)对牛奶中的黄曲霉毒素M1(AFM1)进行检测时,ELISA法可用于定性、定量分析,但可能出现少量的假阳性和假阴性结果,因为ELISA法使用的试剂及样品基质成分复杂,免疫反应过程及显色系统精确机制不明确,易受诸多不确定因素影响,所以免疫测定法需要与理化方法(如HPLC法)进行分析结果相关性试验。

(2)对于已知加标样品(阳性),HPLC法和ELISA法具有良好的相关性,ELISA法样品前处理比HPLC法简便,具有良好的灵敏度和特异性,但可能出现少量的假阳性和假阴性结果,故可作为初步筛选;而对于未知样品,HPLC法的精密度和准确度均良好,是一种有效的确证方法,但样品前处理较繁琐。对于批量牛奶样品的检测,若将HPLC法和ELISA法相结合,即先利用ELISA法快速检测出阳性样品,再经HPLC法准确定量分析,可大大提高检测效率。

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