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线斑激光诱导荧光微池检测器的研制及性能测试

发布时间:2014-03-25 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:842

激光诱导荧光检测器具有灵敏度高、样品用量少等特点,可作为高效液相色谱(HPLC)和高效毛细管电泳(HPCE)的检测器,近年来发展迅速,广泛应用于生物、食品、药品和环境样品等的痕量和超痕量检测[1–7]。线斑激光诱导荧光微池检测器(LIF–D)激光光源根据制造材料不同被分为气体、固体、半导体和有机染料激光器。近年来,半导体泵浦式固体激光器以功耗低、效率高、寿命长、光束质量好、体积小等优点发展迅速[8–11]。LIF–D除立方体式检测池外还有流动液滴检测池、层流池和光导纤维检测池等[12,13],这些检测池各具特点,但多数制作复杂、价格昂贵。

笔者将自行设计委托生产的半导体泵浦式线状光斑激光器和自制石英荧光微池应用于正交型检测结构,而此前未见有线状光斑激光器应用于LIF–D的报道。该光源可增大有效激发光面积,石英荧光微池体积小、价格低、安装简便,得到了较好的实验效果。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

荧光光度计:930型,上海第三分析仪器厂;线斑激光光源:定制,北京榜首科技有限公司;液相色谱输液泵:LC–10AT.VP.Plus型,日本岛津公司;石英荧光微池(配三维可调基座):自制(池体积6μL);色谱工作站:HW–2000型,上海千谱软件有限公司;纯水蒸馏器:SZ–93型自动双重纯水蒸馏器,上海亚荣生化仪器厂;滤光片:610nm;ODS色谱柱:迪马公司;罗丹明B:分析纯,上海源叶生物科技有限公司;罗丹明B储备液:1.00g/L,用三次蒸馏水配制;实验用水为三次蒸馏水。

1.2LIF–D激光光源光学结构

图1为LIF–D结构示意图。

1.3实验方法[14]

开机设置高效液相色谱仪及激光诱导荧光检测器参数,预热约30min至稳定。进样,记录峰高、基线噪声和漂移信号,据此计算信噪比。

2结果与讨论

2.1光路结构对信噪比的影响

2.1.1光路结构

正交型光路结构激发光与发射光成直角,能获得较高信噪比,应用于多种检测器。本实验将激光光源、聚焦透镜、狭缝整体组装;检测微池与三维可调基座组装,方便调节微池位置,以获得最佳检测结果。

2.2.2荧光微池位置

调整检测微池,将光源聚焦至与池体吻合。仪器稳定后进样,记录峰高及基线噪声,计算信噪比。改变微池位置重复检测(图2)。研究结果显示:检测池在b位置时检测信号最大;在a,c位置时信号相对减弱。说明信号大小与光电转换装置接收到的发射光强有关,检测池在光电转换窗口正中时接收到光的强度最大。因此调节检测池位置至窗口正中,以获得最佳实验结果。

2.2.3激光光源位置

微池处于最佳位置,调节光斑使其按图3所示位置照射在微池上,然后进行测定。研究结果显示:光斑于b时检测信号最大;调至a,c时检测信号减弱。说明光斑覆盖荧光微池的面积越大,受激发的荧光分子数越多,检测信号相对增大;光斑在c位置时荧光微池内外壁光学畸变会影响光电转换及放大装置,降低信噪比。因而调节光斑在微池正中,以获得较好的实验结果。

2.3光源输出功率对信噪比的影响

调节电源电流可改变特制光源输出功率。激光输出功率与荧光强度成正比,其平方根与背景噪声成正比;荧光饱和、检测池热效应等负面影响会随输出功率的增大而增大。综合考虑稳压电源输出电流强度对检测结果的影响,从而得到最佳电流强度。选取质量浓度为10–4g/L的样品,测定不同电流强度下的信噪比,结果显示,当电流强度升至2.7A后信噪比趋于稳定,如图4,选择2.8A为最佳工作电流强度。

2.4检测器稳定性

2.4.1基线噪声与漂移

开机预热30min,量程为1.0mV条件下测定基线噪声及漂移。流动相为经0.45μm滤膜过滤的3次蒸馏水,流速为1.0mL/min,实验结果见表1。结果表明连接色谱柱可在一定程度上减轻基线漂移,推测色谱柱能一定程度上降低输液泵工作时的脉冲影响。关泵测定机器噪声,测试结果表明机器稳定性良好,达到设计标准。

2.4.2输出信号稳定性

将质量浓度为10–3g/L的罗丹明B溶液连续进样10次,得相应色谱图,10次峰高数据见表2,由表2可知,峰高测量结果的相对标准偏差为1.2%,表明输出信号比较稳定。

2.5检测器敏感度和线性范围

将罗丹明B储备液配制成不同浓度标样,分别连续进样5次,得到相应响应值和基线噪声,计算信噪比,确定罗丹明B在该检测器下的线性范围和敏感度(S/N=3)。532nm波长下检测罗丹明B样品,质量浓度检出限5.0×10–6g/L,质量检出限1.0×10–10g,线性范围为5×10–6~2×10–2g/L,r=0.9983。

2.6实际样品检测[15]

罗丹明B是一种桃红色人工染料,因其对人体有潜在的致癌致突变因素,被禁止应用于食品、化妆品和玩具等的着色。笔者所提供的检测系统可用于实际样品的测定。图5是某型号金葱粉样品中罗丹明B的色谱图,经检测,该金葱粉样品中罗丹明B含量为0.053g/kg。

3结论

以特制线斑半导体泵浦式激光器和自制石英荧光微池应用于正交型检测结构,线状光斑可增大有效激发光面积;石英荧光微池体积小,安装方便。以罗丹明B评价该检测器各项性能,结合实际样品的测定,结果表明,该检测器线性范围较宽,灵敏度适中,性能良好,结构简单,成本低,便于调试校准,可较好地应用于工业生产的检验检测。若进一步优化光电转换和放大装置,可在提高信噪比、降低检出限、拓宽线性范围等方面获得进一步提高。

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