一、细菌的接种方法

（一）平板划线分离法

平板划线接种是细菌分离培养的基本技术，微生物检验人员必须熟练掌握。划线分离的目的是将标本中混合的多种细菌在平板上分散生长形成单个菌落，为下一步细菌的鉴定等打下基础。平板划线分离方法有以下几种。

1．连续划线分离法连续划线分离法主要用于细菌含量较少的标本（如尿液等），划线时的起始点在平板的1/5处，边缘留有5 mm的空白，以防污染的细菌被划线进入分离区。接种环灭菌、取标本后连续不断地呈密集的“Z”形划线直至划满平板。

2．分区划线分离法分区划线分离法主要用于细菌含量较多的标本（如粪便、脓液、痰液等）的分离培养。将标本接种于第一区并划线，在第二、第三、第四区依次用接种环划线，每区划线完毕均应烧灼接种环，待凉后再划下一区，划线时只接触上一区2～3次，使细菌逐渐减少以便分离出单个菌落。

3．棋盘划线分离法棋盘划线分离法适用于具有重要意义且细菌含量多的标本的分离培养，标本划线时的起始点在平板的1/5处，先平行划线6～8条，然后垂直划线6～8条呈方格状，形似棋盘。

（二）倾注接种法

本法主要用于牛乳、饮用水、尿液等液体标本的细菌计数。用无菌生理盐水将标本做适度稀释后，取1 mL注入已熔化并冷却至5O℃左右的培养基（15 mL）混匀，待冷却后放入35～37℃孵箱中。培养24 h后计数平板上菌落数，再乘以稀释倍数，即可计算出每毫升标本中细菌数量。

（三）穿刺接种法

此法用于保存菌种、观察动力及某些生化反应。用接种针挑取细菌培养物，在半固体培养基中央垂直穿刺至培养基3/4处，然后沿原路小心拔出接种针。

（四）液体接种法

用无菌接种环挑取菌落或标本，在试管内壁与液面交界处轻轻研磨，使细菌混匀于液体培养基内。

（五）斜面接种法

此法主要用于细菌鉴定、保存、观察动力及某些生化反应。用左手握住菌种管和斜面培养基，右手持接种针，右手小指与手掌、小指与无名指分别拔出两管的棉塞，将管口通过火焰灭菌，用接种针挑取菌落，插入斜面培养基3/4处，拔出接种针在斜面上来回蜿蜒划线。管口用火焰灭菌，塞上棉塞，将斜面培养基放入35～37 ℃孵箱孵育。

（六）涂布法

目前该法主要用于纸片扩散法细菌药敏试验时的细菌接种。用无菌棉拭子蘸取一定浓度的菌液在平板上反复涂抹，尽可能使细菌均匀分布于琼脂表面，稍晾干后放置药敏纸片。

二、细菌的培养方法

（一）需氧培养法

需氧培养法又称普通培养法，是指需氧或兼性厌氧菌等在普通大气环境下的培养方法，也是目前微生物实验室最常用的培养方法。将标本接种于相应的培养基如血平板、巧克力琼脂、斜面琼脂、液体培养基等，然后放置于35～37℃培养箱内，孵育18～24 h，满足需氧菌和兼性厌氧菌的生长需k.

（二）C0₂培养法

大部分细菌在一定浓度的CO₂下比在空气环境（含O₂）中生长好，所以临床标本培养除特殊要求外，放在有CO₂的环境中培养比较适宜。有一些细菌如肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、嗜血杆菌、布鲁菌、军团菌等细菌的初代培养时，必须在CO₂浓度为5％～10％的环境中才能生长：常用的方法如下。

1. CO₂培养箱法通过CO₂培养箱自动调节CO₂的进入量，可控制培养箱内CO₂的浓度。设定湿度、温度后实现自动控制。根据需要选择气套或水套等加热方式及箱体大小等。

2．烛缸法接种好的培养基放八烛缸内，缸口磨砂面涂以适量凡士林，缸内靠近中心位置放入点燃的蜡烛，并轻轻转动上盖使之密封，蜡烛燃烧消耗氧气产生CO₂,1 min左右蜡烛自行熄灭，此时CO₂浓度为5％～10％。将烛缸放入35～37℃培养箱中即可。

3．化学法常用碳酸氢钠一盐酸法。按每升体积加入碳酸氢钠0.4 g与浓盐酸0.35 ml的比例配制，分别置于容器内，将接种好的培养基放入其中，盖紧缸盖后慢慢倾斜，当浓盐酸与碳酸氢钠接触后即发生化学反应，产生CO₂。将干燥器放在35～37℃培养箱中即可。

4．气袋法选择无毒无害的带封口的洁净塑料袋，可采用抽气换气法，将接种好的培养基和CO₂产生管放入其中，尽量去除袋内空气后密封袋口。打开CO₂产生管开始产生CO₂，将气袋放入35～37℃培养箱中即可。

（三）微需氧培养法
微需氧菌如弯曲菌在大气中和无氧环境中均不能生长，需要在5％ O₂+10％ CO₂+85％ N₂的环境才能生长。可用“三气”培养箱进行培养。

（四）厌氧培养法

1. 庖肉培养基法培养基中的肉渣含有不饱和脂肪酸以及琉基等还原性物质，能吸收培养基中的氧，而使氧化还原电势降低，在液面覆盖一层无菌凡士林或液体石蜡以隔绝空气，形成良好的厌氧条件以满足厌氧菌生长的需要。方法：先将庖肉培养基在水浴中煮沸10 min，冷却后将标本接种于庖肉培养基内，然后在培养基表面加无菌液体石蜡或凡士
林，37℃孵育24～48 h，观察厌氧菌生长情况。

2．焦性没食子酸法焦性没食子酸加入碱性溶液后能迅速吸收大量的氧，生成深棕色的焦性没食子橙，它能在任何封闭容器内有效地吸收氧而形成利于厌氧菌生长的条件。

3．厌氧缸法将冷触媒把粒10～20颗，煮沸去氧的亚甲蓝指示剂1管，以及接种标本的厌氧琼脂平板一起置于密封缸内。用真空泵抽出缸内空气，充入N₂，反复2～3次后，再冲入85％ N₂+10％ CO₂+5％ H₂的混合气体。37℃孵育24～48 h，观察厌氧菌生长情况。

4．厌氧手套箱法用透明硬质塑料制成密封性能良好的厌氧手套箱，外接厌氧气瓶，箱内用抽气换气法保持厌氧状态。整个过程通过箱体上的橡皮手套在箱内的操作和处理，使培养物不与空气接触，始终保二持厌氧环境。

5．厌氧培养箱法将标本接种于培养基后放入厌氧培养箱内，通过抽气换气去除氧，形成厌氧环境。厌氧培养箱首先必须外接含厌氧气体的气瓶，此气瓶需装有真空表、真空泵、温控器、指示灯、气阀等。