1.糖（醇、苷）类发 酵试验

(1)原理：不同细菌发酵糖类的酶不同，故分解糖的能力不同，所产生的代谢产物也随细菌种类而异。观察细菌能否分解各类单糖（如葡萄糖等）、双糖（如乳糖等）、多糖（如淀粉等）、醇类（如甘露醇等）和糖苷（如水杨苷等），是否产酸或产气。

(2)方法：将纯培养的细菌接种到含各种糖的培养管中，放置于一定条件下孵育后取出，观察结果。

(3)结果判断：若细菌能分解此种糖产酸，则指示剂呈酸性变化；不产酸，则培养基颜色无变化。产气可使液体培养基中倒置的小管内出现气泡，或在半固体培养基内出现气泡或裂隙。

(4)注意事项：糖发酵培养基内不能含有任何其他糖类和硝酸盐，以免出现假阳性反应。因为有些细菌可使硝酸盐还原产生气体，而影响结果观察。

2.葡萄糖代谢类型鉴别试验该试验又称氧化／发酵(O/F)试验。

(1)原理：观察细菌对葡萄糖分解过程中是利用分子氧（氧化型），还是无氧降解（发酵型），或不分解葡萄糖（产碱型）。

(2)方法：从平板上或斜面上挑取少量细菌，同时穿刺接种于2支O/F管，其中1支滴加无菌石蜡油覆盖液面0.3～0.5 cm，经37℃培养48 h后，观察结果。

(3)结果判断：仅开放管产酸为氧化型，两管都产酸为发酵型，两管均不变为产碱型。

(4)注意事项：有些细菌不能在O/F培养基上生长，若出现此类情况，应在培养基中加入2％血清或0.1％酵母浸膏，重做O/F试验。

3.β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）

(1)原理：某些细菌具有β-半乳糖苷酶，可分解邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷，产生黄色的邻-硝基酚。

(2）方法：取纯菌落用无菌盐水制成浓的菌悬液，加入ONPG溶液0.25 ml,35℃水浴，于20 min和3h观察结果。

(3)结果判断：通常在20～30 min内显色，出现黄色为阳性反应。

(4)注意事项：①ONPC。溶液不稳定，若培养基变为黄色即不可再用；②ONPG试验结果不一定与分解乳糖相一致。

4．三糖铁试验(TSI试验）

(1）原理：能发酵葡萄糖和乳糖的细菌产酸产气，使三糖铁的斜面均呈黄色，并有气泡产生；只能发酵葡萄糖，不发酵乳糖的细菌，使斜面呈红色，而底层呈橙黄色；有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，产生硫化氢，硫化氢遇到铅或铁离子形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。

(2)挑取纯菌落接种于三糖铁琼脂上，经35℃培养18～24h。

(3)结果判断：出现黑色沉淀物表示产生硫化氢。

(4)注意事项：三糖铁琼脂配制时，应掌握好高压灭菌的温度和时间，以免培养基中的糖被分解。

5．甲基红试验

(1)原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解为乳酸、甲酸、乙酸，使培养基的pH值降到4.5以下，加入甲基红指示剂即显红色（甲基红变红范围为pH4.4～6.0)；某些细菌虽能分解葡萄糖，如果产酸量少，培养基的pH值在6.2以上，加入甲基红指示剂呈黄色。

(2）方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，35℃培养1～2日，加入甲基红试剂2滴，立即观察结果。

(3)结果判断：呈红色者为阳性，呈黄色者为阴性。

(4）注意事项：①培养基中的蛋白胨可影响甲基红试验结果，在使用每批蛋白胨之前要用已知甲基红试验阳性细菌和阴性细菌做质量控制；②甲基红反应并不因增加葡萄糖的浓度而加快。

6. VP (Voges-Proskaurer）试验VP试验亦称伏普试验。

(1)原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，并进一步将丙酮酸脱羧成为乙酰甲基甲醇，后者在碱性环境中被空气中的氧氧化成二乙酰，进而与培养基的精氨酸等所含的肌基结合，形成红色的化合物，即为VP试验阳性。

(2)操作步骤。

①将待检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，35 ℃孵育1～2天。

②观察方法—贝氏法（Barritt)：观察时按每2 mL培养物加入甲液1 mL、乙液0.4 mL混合，置35℃15～30 min，出现红色为阳性。若无红色，应置37℃4h后再判断，本法较奥氏法敏感。

(3)结果判断：红色者为阳性。

(4)注意事项：a-萘酚酒精容易失效，试剂放室温暗处可保存1个月，KOH溶液可长期保存。

7．淀粉水解试验

(1）原理：产生淀粉酶的细菌能将淀粉水解为糖类，在培养基上滴加碘液时，在菌落周围出现透明区。

(2)方法：将被检菌划线接种于淀粉琼脂平板或试管中，35℃培养18～24 h，加入碘液数滴，立即观察结果。

(3)结果判断：阳性反应时菌落周围有无色透明区，其他地方为蓝色；阴性反应时培养基全部为蓝色。

(4)应用：用于白喉棒状杆菌的生物分型，重型淀粉酶水解试验阳性，轻、中型为阴性；也可用于芽胞杆菌属菌种和厌氧菌某些种的鉴定。

8．胆汁七叶苷试验

(1)原理：在10％～40％胆汁条件下，有些细菌具有分解七叶苷的能力。七叶苷被细菌分解产生七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子发生反应形成黑色化合物。

(2)方法：被检菌接种于胆汁七叶苷培养基中，35℃培养18～24 h，观察结果。

(3)结果判断：培养基基本变黑为阳性，不变色为阴性。

(4)应用：主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别，以及肠杆菌科细菌某些种的鉴别。

9．明胶液化试验

(1)原理：细菌分泌的胞外蛋白水解酶（明胶酶）能分解明胶，使明胶失去凝固能力而液化。

(2）方法：将待检菌接种于明胶培养基中，35℃培养24 h至7天，每24 h取出放入4℃冰箱，约2h后观察有无凝固。

(3)结果判断：如无凝固则表示明胶已被水解，液化试验阳性，如凝固则需继续培养。

(4)注意事项：注意培养时间应足够长，时间不够，容易形成假阴性结果；应该同时作阳性对照和阴性对照。

10.吡咯烷酮芳基酰胺酶(PYR）试验

(1）原理：多数肠球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶(pyrrolidonyl arylamidase)，能水解吡咯烷酮-β-萘基酰胺（L-pyrrolidonyl-(3-naphthylamide, PYR)，释放出β-萘基酰胺，后者可与PYR试剂（N,N-dimethylamino-cinnamaldehyde）作用，形成红色的复合物。

(2)方法：直接取细菌培养物涂在PYR纸片上，放在35℃孵育5 min，滴加PYR试剂。

(3）结果：显红色为阳性，呈无色或不改变为阴性。

11.葡萄糖酸盐氧化试验

(1)原理：某些细菌可氧化葡萄糖酸钾，产生a-酮基葡萄糖酸。a-酮基葡萄糖酸是一种还原性物质，可与班氏试剂反应，生成棕色或砖红色的氧化亚铜沉淀。

(2)方法：将待检菌接种于葡萄糖酸盐培养基中(1 mL)，置于35℃孵育48 h，加入班氏试剂1 mL，于水浴中煮沸 10 min，迅速冷却观察结果。

(3）结果判断；出现黄色到砖红色沉淀为阳性；不变色或仍为蓝色为阴性。

(4）注意事项：隔水煮沸应注意试管受热均匀，以防管内液体喷出。