人类在工农业生产及日常生活中向水体排入大量含氮、磷的污染物，加速了湖泊的富营养化。在富营养化的淡水水体中，当有适宜的化学物理条件时，水体中的藻类短时间内大量繁殖并聚集，这种生态异常现象称为水华。当水华出现时，水面被厚厚的蓝绿色湖靛所覆盖，甚至在岸边大量堆积。藻体在死亡分解过程中，会大量消耗水中的溶解氧使鱼类窒息死亡，尤其是藻类能释放生物毒素——藻毒素［1–2］。淡水中蓝绿藻属分泌产生的蓝藻毒素，是目前已经发现的污染范围最广、研究最多的一类藻毒素。其中LR 型微囊藻毒素（MC–LR）是目前已知的毒性最强、急性危害最大的一种淡水蓝藻毒素，并且常规的水处理工艺无法将其去除。全球已经发生了多起有关藻毒素中毒并引起死亡的事故［3］，世界卫生组织及许多发达国家制定的引用水标准和规范中规定，MC–LR 的含量不得超过1.0 μg／L，我国生活饮用水卫生标准也规定饮用水中的MC–LR 不得超过1.0 μg／L［4］。

目前国内供水行业微囊藻毒素的检测广泛采用高效液相色谱法(HPLC)［5］，ELISA 法应用较少。高效液相色谱法虽然精确，但仪器价格昂贵、样品制备过程复杂、耗时长［6］，并且需要具备一定专业水平的人员操作，检测费用高。美国、德国在20 世纪80年代末就已开始研究免疫检测方法，美国国家环保局(EPA) 目前推行的几种用于检测微囊藻毒素的方法中首推酶联免疫法(ELISA)，世界粮农组织已经向许多国家推荐这项技术。在我国开发和利用免疫检测技术具有良好的发展趋势［1］，因此笔者建立了ELISA 试剂盒法测定水中的MC–LR，试验证明该方法具有灵敏度高、反应快速、简单易操作等优势。

1方法原理

ELISA 试剂盒的原理是直接竞争酶联免疫反应，通过一种单克隆抗体来识别检测微囊藻素。当样品中含有微囊藻素及其类似物时，它们将会与微囊藻素–HRP 竞争和溶液中的微囊藻素抗体结合。微囊藻素抗体与包被在微孔板底部的羊抗鼠二抗结合。经过一个洗涤步骤后加入无色底物，产生颜色反应，加入反应终止液后使颜色由蓝色变为黄色，在450 nm 波长处进行检测，样品中的微囊藻素浓度与吸光度呈反比。

2实验部分

2．1主要仪器与试剂

微量移液器：量程30～300 μL，推荐使用多通道微量移液器，这样可以确保每个反应孔在每个步骤的反应时间趋于一致；酶标仪：450 nm 波长；高速离心机或注射器。96 孔酶标板：12×8 条，包被有羊抗鼠二抗；微囊藻毒素标准溶液:0，0.15，0.40，1.00，2.00，5.00 ng／mL;阳性对照品(PC) ：(0.75±0.185) ng／mL ；微囊藻素–HRP 酶标记溶液；抗体溶液（抗微囊藻素单克隆抗体）；稀释液／空白(Std0) ：用于稀释浓度高于5 ng／mL 的样品；浓缩洗涤液（PBS 缓冲液）：使用时稀释5 倍；底物显色液(TMB) ；终止液：1 mol／L 硫酸；水样：上海自来水厂原水和出厂水。

2．2样品预处理

采集水样于一玻璃容器中，并在24 h 内完成检测。不立即检测的样品需冷藏保存（不超过5 d）或冷冻保存（超过5 d）。取适量样品以10 000 r／min 离心20 min，或使用0.45 μm 超滤膜过滤。若样品MC–LR 含量较高，可用稀释液适当稀释。

2．3实验准备

(1) 实验前提前将试剂盒和样品从冰箱内取出，使其达到到室温(20～25℃ )。

(2) 浓缩洗涤液用去离子水稀释5 倍。

2．4实验方法

(1) 在对应的微孔中加入100 μL 标准溶液、阳性对照品和样品，做2～3 组平行，顺序可参考表1排列，但标准系列应置于同一板条。

(2) 向每个测试孔内加入50 μL 微囊藻素–HRP酶标记溶液。

(3) 向每个测试孔内加入50 μL 抗体溶液，覆上封口膜，在桌上轻轻晃动反应板30 s，小心不要晃出，使各孔中反应物混匀，在室温下(20～25℃ ) 孵育90 min。

(4) 孵育完成后，揭开封口膜，用力地倒掉板中液体，向每个测试孔内加入至少250 μL 稀释后的洗涤液，洗涤液不得溢出，放置1 min 后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，至少重复洗涤3 次。

(5) 向每个测试孔内加入150 μL 底物显色液，覆上封口膜，在桌上轻轻晃动反应板30 s，小心不要晃出，使各孔中反应物混匀。将反应板置于恒温培养箱(20℃ ) 内显色20～30 min。

(6) 从培养箱内取出反应板，揭开封口膜，向每个测试孔内依次加入100 μL 终止液，在桌上轻轻晃动反应板30 s，小心不要晃出。

(7) 在15 min 之内，用酶标仪于450 nm 处读取吸光度。

3结果与讨论

3.1工作曲线绘制及结果计算

计算空白(Std0) 吸光度的平均值B0，及其它标准(Std1～Std5) 吸光度的平均值B，然后计算每个标准的(B／B0)×100% 值，结果见表2。以每个标准的(B／B0)×100% 为纵坐标Y，以对应的微囊藻素浓度(ng／L) 的对数值lgc 为横坐标X 绘制标准曲线，得线性回归方程为Y=–55.743X+207.45，相关系数r=0.999 3。计算样品和阳性对照品的(B／B0)×100% 值，根据标准曲线方程得到相应样品和阳性对照品浓度的对数值，对其求反对数，就可以得到样品和阳性对照品的浓度。

3.2重现性试验

对质量浓度为0.40 ng／mL 的标准溶液重复检测6 次，测得吸光度分别为0.932，0.930，0.919，0.928，0.923，0.920，计算得微囊藻素浓度为0.385，0.387，0.399，0.389，0.394，0.398 ng／mL，相对标准偏差（RSD）为1.50%。由此可见，在使用多通道微量移液器以及严格控制各反应孔反应时间的条件下，重现性较好。

3.3方法的检出限

当微囊藻素浓度低于0.10 ng／mL 时，显色反应不明显；当浓度高于0.10 ng／mL 时，显色反应明显，因此检出限为0.10 ng／mL。

3.4回收试验

选取上海自来水厂原水（1#～5# 样品，经0.45μm 超滤膜过滤后测定）和出厂水（6#～8# 样品）按实验方法进行测定，并做加标回收试验(n=6)，测定结果及回收率计算结果见表3。表3 结果表明，本方法符合饮用水和水源水中微囊藻毒素分析的要求。

4结语

ELISA 试剂盒法与高效液相色谱法相比，具有灵敏度高、反应快速、操作简便等优势，该方法能有效反映水体受微囊藻毒素污染的程度，为制水单位控制和去除水体中的微囊藻毒素提供数据支持，为饮用水的安全性提供保障。

食品中邻苯二甲酸酯类塑化剂的测定及迁移研究进展

随着百姓知情权的提升与食品安全事件的不断曝光，食品安全问题越来越受到人们的关注。2011 年5 月，台湾的“塑化剂”事件在台湾及内地引起轩然大波。而近期的“酒鬼酒”事件使“塑化剂”问题再次成为人们关注的焦点。塑化剂［1］又名增塑剂，是工业上广泛使用的增强柔韧性的高分子材料助剂。商品化的增塑剂品种繁多，以原料来源于石油化工的邻苯二甲酸酯(PAEs) 为最多。2011 年5 月起台湾食品中先后检出邻苯二甲酸二乙基己酯（DEHP）、邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）、邻苯二甲酸二正辛酯（DNOP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）等6 种邻苯二甲酸酯类塑化剂成分，药品中检出邻苯二甲酸二异癸酯（DIDP）。人类长期暴露于PAEs 可能引起生殖系统异常，甚至有造成畸胎、癌症的风险［2］，而食品是人类接触PAEs 的最主要来源之一。2011 年6 月1 日我国卫生部将17 种邻苯二甲酸酯类物质列为违法添加的非食用物质。在2000～2011 年间，以邻苯二甲酸酯为主题词发表的文章总体呈递增的趋势，一些文献总结了2008 年以前的科研工作［2–3］。在前人的基础上，笔者简要总结了2009 年至今的食品中邻苯二甲酸酯类化合物在来源、分析测定方法及迁移方面的研究进展，结合实际检验工作，概括目前国内邻苯二甲酸酯检验遇到的主要问题。

1食品中邻苯二甲酸酯的来源

食品中PAEs 污染除从环境吸收外，主要还包括从包装材料中或其它接触材料中迁移：PVC 管、食品包装膜、瓶盖垫圈、PVC 手套、印刷油墨等［2］；对于台湾塑化剂事件而言，另一个来源是人为恶意添加。关于食品中邻苯二甲酸酯的污染问题在国内也倍受关注。吉林省关于11 类食品107 份样品中邻苯二甲酸酯类残留量研究报告［4］显示，食用植物油中的14 个产品不同程度检测出邻苯二甲酸酯类化合物，超出国家标准GB 9685–2008 中DBP，DEHP，DINP 的迁移限量。柳春红等［5］发现在56 袋市售方便面、25 袋方便米粉中，存在不同程度的塑化剂DBP 和DEHP。吴惠勤等［6］收集了华南地区市场上不同类型样品1 426 个，在细分食品类别的基础上采取不同的分离、净化方法，并采用气相色谱– 质谱(GC–MS) 方法研究食品中21 种邻苯二甲酸酯的污染情况。在所检测的样品中，检出DEHP，DIBF，DBP，DINP，DIDP，DEP 等6 种塑化剂，

检出频次最高的为DEHP ；高浓度甜橙油香精和柠檬油香精塑化剂检出量超过国家控制标准(DEHP 1.5 mg／kg)。对其原料油进行检测，确定上述两种香精中的DEHP 污染均为原料油引入。探讨了DEHP 和DNOP 的质谱碎裂机理。另有报道温室PVC 薄膜中DEHP 对蔬菜的污染程度与薄膜厚度、薄膜的新旧程度、温室内的高度都息息相关［7］。

2食品中邻苯二甲酸酯分析测定方法

食品中邻苯二甲酸酯的分析过程包括样品制备、提取、净化、分离和检测等步骤，其中提取和净化是整个检测过程中耗时量最大，并且是决定方法检出限的关键步骤［2］。

2．1提取和净化

由于邻苯二甲酸酯是亲脂性化合物，可以运用相似相溶的原理进行提取。对于基质相对简单的样品（如饮料、水），通常选用正己烷［8–9］、甲醇［5，10］等有机溶剂进行液液萃取；对于含油、含乳基质相对复杂的样品，提取后则需增加净化这一环节。凝胶渗透色谱（GPC，gel permeationchromatography）［11–13］、固相萃取（SPE，solid-phaseextraction）［12，14–18］和分散固相萃取（dispersive solid-phaseextraction）［19–21］是近年来兴起的净化分离技术，越来越受到质检工作者和科研工作者的青睐。Labtech 公司与清华大学［11］合作建立了油脂食品（方便面、油炸糕点、沙琪玛、食用油等）中5 种主要邻苯二甲酸酯类增塑剂的凝胶渗透色谱(GPC) 净化– 高效液相色谱(HPLC) 分析方法，目标物的检出限（S／N=3）为3.25～13.4μg ／L。孙汉文课题组［12］结合微波辅助萃取、凝胶渗透色谱、固相萃取前处理方法与高分辨气相色谱– 串联质谱多种技术，测定食用油中μg／kg 级的20 种邻苯二甲酸酯。该多残留分析方法检出限达到0.218 μg／kg，定量限为0.72～4.51 μg／kg，回收率高于93.04%。实际样品分析表明该方法能够灵敏准确地对高脂肪复杂混合物中邻苯二甲酸酯进行定性、定量分析。由于邻苯二甲酸酯类化合物存在广泛，为了降低空白值，所用器材避免使用塑料制品。一般为邻苯二甲酸酯设计的商品化固相萃取小柱（乙二胺-N- 丙基硅烷（PSA）［14，17］）均为玻璃外壳。科研工作者引入电纺丝［22–23］和分子印迹［24］技术制备具有微纳米结构的固相萃取柱基材，结合液相色谱法、气相色谱法测定食品中的邻苯二甲酸酯。

2．2检测方法总结国内外的学术报道和国家标准，食品中邻苯二甲酸酯类增塑剂的测定方法主要有液相色谱法（LC）［11，19，22，23］、毛细柱气相色谱法（GC）［5，24］、气相色谱– 质谱联用法（GC–MS）［14，15，21，25，26］、液相色谱– 质谱联用法（LC–MS）［20，27］、气相色谱– 串联质谱法（GC–MS／MS）［12］、液相色谱– 串联质谱法（LC–MS／MS）［10，16］等。目前我国国家标准GB／T21911–2008［8］和GB／T 21928–2008 ［28］均采用气相色谱– 质谱联用法。

邻苯二甲酸酯种类繁多，故多种组分残留的同时检测成为迫切的需求。国家标准已将邻苯二甲酸酯的数目由原来16 种增加到22 种，虽然最新的PAEs 行业标准还未公布，但相关研究内容已经发表。郑向华等采用固相萃取– 气相色谱– 质谱分析方法同时检测食品中23 种邻苯二甲酸酯类化合物［14］。样品经正己烷或乙腈提取，玻璃ProElut PSA 固相萃取小柱净化，GC–MS 选择离子监测模式（SIM）测定。23 种邻苯二甲酸酯线性范围除了DINP 和DIDP 为0.5～5mg／L，其余均为0.05～5 mg／L，方法检出限（S／N=3）为0.005～0.05 mg／kg，定量限（S／N=10）为0.02～0.2 mg／kg。由于DINP 和DIDP 存在多种同分异构体，在气相色谱或者气相色谱– 质谱的谱图中为五指峰，不容易准确定量，易出现误判。徐敦明等［10］尝试用液相色谱– 串联质谱法进行测定，结果显示DINP 只出一个峰，易于定量。随着大型仪器的不断更新换代，各个仪器公司不断推出三重四级杆质谱联用仪，飞行时间检测器质谱，气相色谱–质谱联用仪、液相色谱– 质谱联用仪的性能和灵敏度等各方面逐步完善，仪器检测限已降低至皮克级。但由于邻苯二甲酸酯类存在广泛，基质复杂，因此探索更绿色、高效、快速的前处理方法仍然是科研工作的热点之一。

3邻苯二甲酸酯的迁移研究

食品包装材料中邻苯二甲酸酯的迁移一方面影响聚合物材料本身的韧性等机械性能；另一方面，消费者食用了塑化剂污染的食品，对健康造成威胁。因此研究增塑剂的迁移量，总结迁移规律，是制定邻苯二甲酸酯限量标准亟待解决的问题。

食品包装材料中邻苯二甲酸酯的迁移试验是指塑料制品中的邻苯二甲酸酯采用模拟液浸泡溶出目标物，进而测定其迁移量，从而进行毒理性评估和极限限量的确定。我国进出口标准SN／T 2037–2007［29］中采用的模拟液为蒸馏水、3%（质量分数）乙酸、15%（体积分数）乙醇和异辛烷分别模拟pH ＞ 4.5 的水性食品，酸性食品（pH ≤ 4.5 的水性食品），酒精食品和油脂食品，并对迁移条件中时间和温度作了明确规定。

Fasano 等［30］研究了食品包装中邻苯二甲酸酯、甲基酚、双酚A 和DEHA 等多种化学物质在模拟液（蒸馏水、3% 乙酸和15% 乙醇）中的迁移。迁移实验比较了40℃培养10 d和超声提取两种提取方法，发现40℃培养10 d 的提取效果更好。除了通过上述方法研究邻苯二甲酸酯的迁移情况，还可以通过数学模型的方法预测邻苯二甲酸酯向食品的迁移。但各种理论模型相对复杂并且有一定的局限性，至今它们在邻苯二甲酸酯的迁移评估上仍未被推广。模拟物和复杂的实际食品样品存在差异，因此有必要研究邻苯二甲酸酯向实际样品中的迁移情况。Xu 课题组［22］以DBP 为例，考察了不同温度下（4，20，40℃），包装材料中DBP 向矿泉水和食用油中的迁移量在两个月内的变化关系，拟合之后得到二次函数的数学模型。该数学模型有望成为预测PAEs 塑化剂向实际食品样品迁移的工具。

4我国邻苯二甲酸酯类塑化剂检验面临的问题

目前我国邻苯二甲酸酯类塑化剂检验所面临的问题主要包括以下几方面：

(1) 国标GB 9685–2008［31］中只给出DBP，DEHP 和DINP 的迁移限量，其它邻苯二甲酸酯的限量还有待于确定。(2) 我国至今未公布食品中邻苯二甲酸酯的限量标准，严重影响结果判定。我国卫生部在2011 年6 月1 日公布了17 种邻苯二甲酸酯类物质为违法添加的非食用物质。2011 年6 月27 日最新起草并正式通过审订和验证的行业标准《 食品中邻苯二甲酸酯测定》［32］，可一次性检测22 种邻苯二甲酸酯（包括国际高度关注的DINP，DIDP 和DAP等），检出限（0.01～0.5 mg／kg）低于现行国家标准（GB／T21911–2008 中含脂类食品检出限为1.5 mg／kg，非含脂类食品检出限为0.05 mg／kg ；GB／T 21928–2008 各邻苯二甲酸酯化合物的检出限为0.05 mg／kg）。而GB 9685–2008［31］规定了DEHP 从食品包装材料迁移到食品的最大允许迁移量为1.5 mg／kg，DBP 为0.3 mg／kg，DINP 为9 mg／kg。虽然科研工作不断地努力改进前样品前处理技术，采用先进的仪器，提高工作效率和准确性，更加精准地检测出更微量的邻苯二甲酸酯类物质，但质检部门缺少判定依据，仍无法判定是在食品中故意违法添加的，还是从食品包装材料中迁移的。

由此可见，我国的检测标准还需要不断完善；限量标准还存在很多空白，与发达国家相比存在很大差距，应学习国外先进标准并有选择的采纳。

5面对食品安全危机，应采取的态度［33］2010 年12 月7 日，国务院新闻办公室发布《中国的对外贸易》白皮书［34］，数据显示，2010 年中国出口美国的食品为12.7 万批，合格率99.53%，出口欧盟的食品13.8 万批，合格率99.78%。由此可见，中国完全有能力解决食品安全问题，首先要做的是提高国家标准要求，与出口标准要求接轨，同时，政府部门要加大监管力度，严把源头质量关。在邻苯二甲酸酯类塑化剂的研究方面，仍需要建立更优化的检验方法，更多地涉猎新的目标物，深入研究邻苯二甲酸酯类塑化剂的迁移及代谢规律，使研究更趋于系统化、深层化，为早日出台食品中邻苯二甲酸酯类塑化剂的限量标准提供技术支持。