1．枸橼酸盐利用试验

(1)原理：在枸橼酸盐培养基中，细菌能利用的碳源只有枸橼酸盐。当某种细菌能利用枸橼酸盐时，可将其分解为碳酸钠，使培养基变为碱性，pH指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿色变为深蓝色。

(2）方法：将待检细菌接种于枸橼酸盐培养基斜面，于35℃孵育1～4天。

(3)结果判断：培养基由淡绿色变为深蓝色者为阳性。

(4)注意事项：接种菌量应适宜，过少可发生假阴性，接种过多可导致假阳性。

2．丙二酸盐利用试验

(1)原理：在丙二酸盐培养基中，细菌能利用的碳源只有丙二酸盐。当某种细菌能利用丙二酸盐时，可将其分解为碳酸钠，使培养基变为碱性，pH指示剂溴麝香草酚蓝，由淡绿色变为深蓝色。

(2)方法：将待检细菌接种于丙二酸盐培养基上，于35℃孵育1～2天，观察结果。

(3）结果判断：培养基由淡绿色变为深蓝色者为阳性。

(4）注意事项：某些利用丙二酸盐的细菌产碱量少，造成判断困难。可将其与未接种的培养基进行对比。培养48 h后有蓝色表示为阳性，阴性结果必须在培养48 h后才能作出判断。

3．乙酰胺利用试验

(1)原理：非发酵菌产生脱酰胺酶，可使乙酚胺经脱酚胺酶作用释放氨，使培养基变为碱性。

(2)方法：将待检菌接种于乙酰胺培养基中，于35℃孵育24～48 h，观察结果。

(3)结果判断：培养基由黄色变为红色为阳性，培养基颜色不变为阴性。

(4)应用：主要用于非：发酵菌的鉴定。铜绿假单胞菌、无色杆菌、代尔伏特菌为阳性，其他非发酵菌大多数为阴性。

4.醋酸盐利用试验

(1)原理：细菌利用铵盐作为唯一氮源，同时利用醋酸盐作为唯一碳源时，可在醋酸盐培养基上生长，分解醋酸盐产生碳酸钠，使培养基变为碱性。

(2）方法：将待检菌接种于醋酸盐培养基斜面上，于35℃孵育7天，逐日观察结果口

(3）结果判断：斜面上有菌落生长、培养基变为蓝色为阳性，否则为阴性。

(4）应用：肠杆菌科中埃希菌属为阳性，志贺菌属为阴性；铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌等非发酵菌为阳性。

二、酶类试验

1．触酶试验

(1)原理：具有触酶（过氧化氢酶）的细菌，能催化过氧化氢放出新生态氧，继而形成气泡。

(2)方法：取3％过氧化氢溶液0.5 ml,滴加于不含血液的细菌培养基上，或取1～3 ml。滴加于盐水菌悬液中。

(3)结果判断：培养物出现气泡者为阳性。

(4)注意事项：①细菌要求新鲜；②不宜用血平板上的菌落做触酶实验，因红细胞内含有触酶，可能出现假阳性；③需用已知阳性菌和阴性菌做对照。

2.氧化酶试验

(1)原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再用氧化型细胞色素C使对苯二铵氧化，生成具有颜色的醌类化合物。

(2)方法：取洁净的滤纸一小块，蘸取菌苔少许，加一滴10 g/L盐酸对苯二铵溶液于菌落上，观察颜色变化。

(3）结果判断：立即呈粉色并迅速转为紫红色者为阳性。

(4)注意事项：①试剂在空气中容易氧化，故应经常更换试剂，或配制时在试剂内加入0.1％维生素C以减少自身氧化；②不宜采用含有葡萄糖的培养基上的菌落（葡萄糖发酵可抑制氧化酶活性）；③实验时应避免含铁的培养基等含铁物质，因本实验过程中遇铁时会出现假阳性结果。

3.靛酚氧化酶试验

(1)原理：具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使盐酸对二甲胺基苯胺氧化，并与a-萘酚结合，产生靛酚蓝而呈蓝色。

(2)方法：取靛酚氧化酶纸片用无菌盐水浸湿，然后直接蘸取细菌培养物，立即观察结果。

(3）结果判断：纸片在10 s内变成蓝色为阳性。

4．血浆凝固酶试验

(1)原理：金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶。一种是结合凝固酶，即结合在细菌细胞壁上，为纤维蛋白原的受体，能与血浆中的纤维蛋白原结合，可用玻片法测出。另一种是游离凝固酶，为分泌至菌体外的蛋白质，能被血浆中的协同因子激活成为凝血酶样物质，从而使血浆发生凝固。

(2）方法。

①玻片法：取兔或人血浆和生理盐水各一滴分别置于清洁玻片上，挑取待检菌落分别与血浆及生理盐水混合。如果血浆中有明显的颗粒出现而生理盐水中无自凝现象为阳性。

②试管法：取试管3支，分别加,0.5 mL的血浆（经生理盐水1:4稀释），挑取菌落数个加入测定管充分研磨混匀，将已知阳性菌株和阴性菌株加入对照管，37℃水浴3～4 h。血浆凝固为阳性。

(3）注意事项：若被检菌为陈旧的肉汤培养物（大于18～24 h)或生长不良、凝固酶活性低的菌株往往出现假阴性。该试验需要设阳性对照与阴性对照。

5. DNA酶试验

(1)原理：某些细菌可产生细胞外DNA酶。DNA酶可水解 DNA长链，形成数个寡核昔酸链，后者可溶于酸。在平板上加入酸后，若菌落周围出现透明环，表示该菌具有DNA酶。

(2)方法：将待检细菌点种于DNA琼脂平板上，35℃培养18～24 h，在细菌生长物上加一层1 mol /L，盐酸（使菌落浸没）。

(3)结果判断：菌落周围出现透明环为阳性，无透明环为阴性。

(4）注意事项：培养基表面凝固水需烘千，以免细菌蔓延状生长。也可在营养琼脂的基础上增加0.2 % DNA。

6．硝酸盐还原试验

(1)原理：硝酸盐培养基中的硝酸盐可被某些细菌还原为亚硝酸盐，后者与乙酸作用产生亚硝酸。亚硝酸与对苯氨基苯磺酸作用，形成偶氮苯磺酸，再与a-萘胺结合生成红色的N-a-萘胺偶氮苯磺酸。

(2)方法：将待检细菌接种于硝酸盐培养基中，于35 ℃孵育1～2天，加入甲液和乙液各2滴，即可观察结果。若加入硝酸盐试剂不出现红色，需检查硝酸盐是否被还原。可于原试管内加入少量锌粉，如出现红色，证明产生芳基肼，表示硝酸盐仍然存在；若仍不产生红色，表示硝酸盐已被还原为氨和氮。也可在培养基内加1支小倒管，若有气泡产生，表示有氮气产生，用以排除假阴性。如铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等可产生氮气。

(3)结果判断：呈红色者为阳性。若不呈红色，再加入少量锌粉，如仍不变为红色者为阳性，表示培养基中的硝酸盐已被还原为亚硝酸盐，进而分解成氨和氮。加锌粉后变为红色者为阴性，表示硝酸盐未被细菌还原，红色反应是由于锌粉还原所致。

(4)注意事项：本实验在判定结果时，必须在加试剂之后立即判定，否则会因迅速褪色而造成判定困难。