随着现代医学如免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，新的细菌检测技术和方法广泛用于临床微生物的鉴定。传统的细菌分离、培养及生化反应等，已不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学研究的一要求。近年来国内外学者不断努力，创建了不少快速、简便、特异、敏感、低耗且实用的细菌学检测方法。

一、免疫学检测

免疫学方法在细菌学诊断中的应用日益受到关注，用已知抗原或抗体检测抗体或抗原，从而丰富和简化了病原微生物的鉴定手段。

（一）凝集试验

颗粒性抗原如细菌、细胞、乳胶等与相应抗体发生特异性结合，在一定条件下形成肉眼可见的凝块，称为凝集试验（agglutination test)。

1．直接凝集试验（direct agglutination test)

(1)玻片凝集试验：是一种定性试验，用已知抗体检测未知抗原，常用于细菌的鉴定和分型，如沙门菌属、志贺菌属、致病性大肠埃希菌、弧菌属、嗜血杆菌、布鲁菌等细菌的鉴定，以及链球菌初步分型。本法操作简便、实用性强。

(2)试管凝集试验：是一种半定量试验。用等量的抗原（细菌）与一系列倍比稀释的抗体（抗血清）混合，在37℃孵育4h后放室温或4℃冰箱过夜，次日观察结果。以最高血清稀释倍数出现“++”凝集的稀释度表示抗体的效价。

2．间接凝集试验(indirect agglutination test）可溶性抗原或抗体吸附于一种与免疫反应无关的、大小均匀一致的颗粒性载体上，形成致敏颗粒，再与相应的未知抗体或抗原作用，在电解质存在的适宜条件下，被动地使致敏颗粒出现肉眼可见的凝集现象，称为间接凝集试验。常用于检测血清中细菌、螺旋体、病毒等抗原。间接凝集试验分为正向间接凝集试验、反向间接凝集试验、间接凝集抑制试验和协同凝集试验。

(1)乳胶凝集试验。将特异性抗体包被在乳胶颗粒上，通过抗体与相应的细菌抗原结合，产生肉眼可见的凝集反应。通常需获得细菌纯培养物，再将培养物与致敏乳胶反应。常用于大肠埃希菌0157:H7鉴定。

(2)协同凝集试验。金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与人及各种哺乳动物IgG的Fc段结合的能力，而不影响抗体Fab段的活性，采用抗体致敏的SPA检测细菌即协同凝集试验。

（二）沉淀试验

可溶性抗原与相应抗体结合，在比例适当和电解质存在的条件下，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀试验（precipitation test)，包括环状沉淀、絮状沉淀和琼脂扩散三种基本类型。

1．环状沉淀试验 将已知的抗血清加于内径1～3 mm，长75 mm的玻璃试管中约1/3高度，然后沿管壁慢慢加入稀释的待测抗原溶液，成为交界清晰的两层，置于35℃孵育5～30 min。如果液面交界处形成白色环状沉淀物为阳性。本试验主要用于链球菌、肺炎链球菌、鼠疫耶尔森菌的微量鉴定。

2.絮状沉淀试验 可溶性抗原与抗体在试管中以适当比例混合，在电解质存在的条件下，出现絮状沉淀物。本试验可用于毒素、类毒素、抗毒素的定量测定。

3．琼脂扩散试验 用琼脂制成凝胶，使抗原和抗体在凝胶中扩散，在两者比例适当处形成肉眼可见的沉淀线，为阳性反应。琼脂扩散试验可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验两种，常用于标本中的抗原或抗体测定以及纯度鉴定。

（三）免疫荧光技术

免疫荧光（immunofIuorescence, IF)技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光。免疫荧光技术主要有直接法和间接法。直接法是将标记特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片，在荧光显微镜下观察结果。间接法：①如检查未知抗原，先用已知未标记特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗球蛋白抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原一抗体一抗体复合物（Ag-Ab-Ab * )，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片，在荧光显微镜下观察结果；②如果检查未知抗体，则抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其他步骤的抗原检查相同。

（四）酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）的应用，大大提高了检测的敏感性和特异性，现已广泛应用于病原微生物的检验。常用的方法有间接法、竞争法、双抗体或双抗原夹心法、捕获法、生物素-亲和素系统等。

二、分子生物学技术检测

随着分子生物学技术的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态、结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平研究生物大分子，特别是核酸结构、组成及功能。在此基础上建立了众多检测技术，如核酸探针（nuclear acid probe）和聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR)，以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的产物，已广泛应用于临床病原微生物检测。

（一）核酸探针杂交技术

1．核酸探针杂交技术原理根据完成杂交反应所处介质的不同，分成固相杂交和液相杂交。固相杂交是在固相支持物上完成的杂交反应。预先破碎细菌使之释放DNA，然后把获得的DNA固定在硝基纤维素膜上，再加标记探针杂交，根据颜色变化确定结果，该法是最原始的探针杂交法，容易产生非特异性背景干扰。固相杂交技术有斑点杂交、原位杂交、Southern印迹、Northern印迹等。液相杂交法指杂交反应在液相中完成，不需固相支持，优点是杂交速度比固相杂交快，缺点是为消除背景干扰必需进行分离以除去加入反应体系中的干扰剂。

2．核酸探针的类型根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可分为DNA探针或RNA探针，一般大多选用DNA探针。根据选用基因的不同分成两种，一种探针能同微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性；另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应，如编码致病性的基因组，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。这类探针检测的基因相当保守，包括大部分rRNA，因为其既可在一种微生物中出现，又可代表一群微生物。

3．核酸探针的应用

(1)用于检测无法培养，不能用做生化鉴定、不可观察的微生物产物以及缺乏诊断抗原等方面的检测，如肠毒素口

(2)检测细菌的耐药基因。

(3)用于细菌分型，如rRNA分型。

4．核酸探针的特点

(1)探针的特异性。探针检测技术的最大优点是特异性，一个DNA探针能特异性地与所检微生物而不与其他微生物发生反应。

(2)探针的敏感性。DN /L探针敏感性取决于探针本身和标记系统。32 P标记物通常可检出相当于0.5pg,1000个碱基对的靶系列，相当于1000～1000。个细菌。用亲和素标记探针检测lh培养物DNA含量在110pg，两者敏感性大致相同，而血清学方法只能达到1 ng的水平。

（二）聚合酶链反应（PCR）的原理及发展

1. PCR原理 1983年Millus和Cetus发明了扩增DNA或增加样品中特殊核苷酸片段数量的聚合酶链反应，即PCR法。PCR法建立在三步重复发生反应的基础上：①通过热处理将双股DNA变性裂解成单股DNA;②退火、延伸引物至特异性寡核苷酸上；③酶促延伸引物与DNA配对合成模板。变性DNA片段、退火、引物杂交形成的模板可参与再次反应。因此，每次循环特异性DNA将以双倍量增加。经过35次循环能引起100万倍的扩增。在PCR反应中引入Taq聚合酶使反应得以半白动化和简化反应程序。用扩增DNA进行的PCR反应具有无与伦比的优越性。PCR的缺点主要是系统容易受外源DNA的污染，并随样品中待检DNA一起扩增。

2. Qp复制酶法 Gene-Tack改良了PCR法，建立了Qβ复制酶系统扩增法，其命名是根据反应过程中起扩增作用的酶来确定的。通过探针与靶DNA相结合，系统以酶学方法促进扩增。该探针是含有一个模板区域的RNA探针，其三级结构称为MDV1。系统含有RNA指导的 RNA聚合酶、Qβ复制酶。扩增MDV-1的速度很快。每循环一次需15～20 s，共循环15～30 min。千分之一含量的RNA可扩增到125～200 ng，一亿倍扩增。由于大量合成RNA，用简单的比色法就能检测杂交反应。反应呈动力学特征，建立标准曲线，确定初始结合物浓度即可定量分析。其缺点是酶易受污染，导致敏感性下降，背景干扰限制了方法的实际应用。

3．连续扩增反应法（Lar)Lar是在PCR基础上的一种改进，同PCR的不同之处在于它不扩增单个核昔酸形成DNA分子，而用一种称作T4DA的连接酶把两个寡核昔酸彼此相连。通过连接酶的作用两者能相互交联，在这种情况下，同PCR反应一样，连接的寡核苷酸沿原始系列排列，并成为下次循环的模板。循环20～30次可把原始靶DNA含量增加100万倍。但它需对整个靶DNA序列事先有明确了解，否则一个碱基错配就会导致寡核苷酸相互连接失败。

4．转录放大系统（TAS/3SR/NASBATM)1989年Kwoh等介绍了一种新技术，即转录扩增系统（TAS)，它是包括DNA合成和RNA转录的双重循环过程。它以变性DNA和一般RNA为引物的寡核苷酸靶序列，这个寡核苷酸上包含多聚酶结合部和与靶序列互补配对的片段。杂交时，引物与靶序列结合，逆转录酶延伸引物与靶序列互相配对，热变性后，另外一个寡核昔酸退火成新股DNA。再加入逆转录酶产生与新股DNA互补的双股DNA。并延伸原始的已退火的引物至另外一个靶序列上。加入RNA聚合酶，可以扩增RNA的拷贝数（10～1000)。仅需4次循环就能得到RNA分子1000000个拷贝数。

5．放大信号检测法放大信号同时能改善DNA探针的敏感性。有些学者研究出用腺嘌呤酯标志DNA的生物化学检测方法，反应初始时需加入H₂O₂,酯结构的破坏会产生光，光亮强度与存在的靶DNA含量成比例关系，也有人用一种称作磷酸苯二氧化物作生物发光剂，此物质在碱性磷酸酶作用下转化为发光物质，用比色法检测，它比OPD和HRP敏感10倍以上。生物化学发光法在DNA探针检测上效果很好。