细菌毒素检测和基因芯片技术
来源/作者:中国标准物质网  日期:2017-08-22

一.细菌毒素检测

(一)内毒素含量的侧定

内毒素是革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖成分。当感染此类细菌时,可由血液、脑脊液等体液标本中检测出内毒素,从而协助临床诊断。另外,在生产药剂(如各种药物及输注用生理盐水、葡萄糖盐水等)及各种生物制品过程中,白然环境中具有内毒素的细菌常污染药剂、生物制品等,导致患者内毒素中毒,所以这类药剂在出厂前要严格检测内毒素。内毒素检测方法包括鲎试验和动物实验(家兔发热法)等。内毒素检测的动物实验由于操作烦琐,且干扰因素多,结果的准确性难以保证,故一般不再使用。现主要采用鲎试验、免疫学方法、生物学方法、化学发光方法及高效液相色谱等测定样品中的微量内毒素。

1. 鲎试验 鲎是一种海洋节肢动物,其血液中有一种变形细胞,该细胞的裂解产物可与细菌的内毒素起凝胶反应。由于该细胞的裂解物中的一种酶被细菌内毒素中的脂多糖激活,在极微量内毒素(0.0005 ug/mL)存在时即可使其蛋白形成凝胶,本试验即利用此原理测定血液或其他样品中的微量内毒素。

2.免疫学方法酶联免疫吸附检测法(LAL-ELISA )、火箭免疫电泳鲎试验法(TAL-RIE)、双抗体夹心ELISA,L-聚赖氨酸ELISA法等均可定量检测内毒素,其特异性强、准确性高,但操作方法尚需进一步简化。

3.其他方法如生物学方法、化学发光方法及高效液相色谱等也可用于内毒素含量的测定。

(二)外毒素含量的测定

外毒素是许多革兰阳性菌及部分革兰阴性菌在生长繁殖过程中分泌到菌体外的一种代谢产物,其主要成分为蛋白质。外毒素的测定主要用于某些待检菌的鉴定以及产毒株和非产毒株的鉴别。

1.体内毒力试验 细菌外毒素对机体的毒性作用可被相应抗毒素中和,若先给动物注射抗毒素,然后再注射外毒素,则动物不产生中毒症状,可依此来鉴定细菌是否产生与抗毒素相对应的外毒素。

2.体外毒力试验外毒素抗原性强,可刺激机体产生相应抗体。在体外以已知外(类)毒素特异性免疫血清(抗毒素)与被检外毒素(抗原)进行抗原一抗体反应,来检测外毒素,以鉴定细菌是否产生该毒素,如白喉棒状杆菌的Elek平板毒力测定。还可以用ELISA检测细菌外毒素,如葡萄球菌肠毒素、肠产毒素型大肠埃希菌LT和ST等的测定。

二、基因芯片技术

基因芯片又称DNA芯片(DNA chip), DNA微阵列(DNA microarray)、寡核酸阵列(oligonucleotide array),是专门用于核酸检测的生物芯片技术。在固相载体(玻片、硅片或硝酸纤维素膜等)上按照特定的排列方式固定大量已知序列的DNA片段或寡核昔酸片段,形成微矩阵。将样品基因组DNA/RNA通过体外逆转录,PCR/RT-PCR扩增等技术掺入标记分子后,与位于微矩列上的已知序列杂交,通过激光共聚焦显微扫描技术检测杂交信号强度,经过计算机软件进行数据的比较和综合分析后,即可获得样品中大量基因序列特征或基因表达特征信息。基因芯片技术的优点:①检测结果客观、快速、准确,6~7 h可报告结果;②可在一张芯片上同时检测多种细菌;③能特异性检测细菌的种和亚型;④能够排
除非特异检测方法的混杂因素如体外培养等;⑤对一些需要特殊培养以及不能培养的细菌也可检测;⑥自动化程度较高,有利于大样本自动化检测。

三、动物实验

动物实验的用途很广,在临床微生物学检验中,主要用于分离和鉴定病原菌,检测细菌毒力,制备免疫血清以及生物制品的安全与毒性试验等。常用的实验动物有小白鼠、大白鼠、豚鼠、家兔和绵羊等。

(一)实验动物的选择

选用合适的实验动物对保证实验结果的准确性、可靠性十分重要,包括实验动物对微生物感染的敏感性、动物的遗传种系特征、动物体内和体表微生物群特点,以及实验动物的体重、年龄、性别和数量等。

1.易感动物的选择由于实验动物的种类很多,生理特点各不相同,因此,在动物实验时不能随意选择一种动物进行实验。经典的微生物试验动物模型有小自鼠腹腔接种的肺炎链球菌感染,豚鼠的结核分枝杆菌感染等。

2.等级动物的选择根据试验性质和要求,可选择健康的纯系动物、突变动物、无菌动物、已知指定菌群动物及无特定病原菌动物等。

(二)动物接种

根据实验要求和目的,选择注射或接种部位。

1.皮内注射常选择动物的背部或腹部皮肤,去毛,用75%乙醇消毒,用4号小针头刺入真皮层内注射,注射部位有小圆隆起,注射量为0.1~0.2 mL。

2.皮下注射常选择动物的背部或腹部皮肤,去毛消毒后,轻轻捏起皮肤,注射0.5~l.0 mL,注射部位应出现扁平隆起,避免注入腹腔。

3.肌肉注射一般选择臀部和大腿部,局部消毒后注入肌肉,注射量一般为0.2~1.0 mL。

4.小白鼠腹腔注射左手一拇指和食指捏住小白鼠的两个耳朵及头部皮肤,再用环指和小指将尾巴固定在手掌上,使其头部略有下垂,腹部局部消毒后,右手持注射器刺入腹腔,注射0.5~l.0 mL接种物。

5.兔静脉注射将兔置于固定架内,耳部外缘消毒,耳缘静脉明显凸起,由耳尖部开始顺血管方向刺入。

6.脑内注射在动物外耳道至眼上角直线1/2处,消毒后刺入颅内,缓慢注射接种物,注射量因动物而定,一般为0.03 mL。

7.接种后动物观察动物接种后应每天观察一次,根据实验要求做详细记录,注意动物的饮食、精神状态及接种部位的变化,同时注意体温、呼吸、脉搏等生理体征的变化。如动物死亡应立即解剖或冷藏后迅速解剖,以防尸体腐败变质,影响实验结果。

(三)动物解剖

动物死亡后或处死后,解剖方法通常按以下步骤进行。

(1)将动物尸体仰面固定于解剖台上,小白鼠可用大头针固定在解剖台上,较大的动物如家兔、豚鼠可用钢钉固定在解剖台上。

(2)检查接种部位有无炎症、脓肿等表现,然后用无菌镊子和剪刀将动物自耻骨至颈部的皮肤作纵向剪开,再用刀背使皮肤与皮下组织剥离。检查皮下组织和腋下、腹股沟淋巴结有无病变。必要时作涂片和培养检查。

(3)自耻骨至横隔剪开腹肌,检查腹腔内有无渗出液及肝、脾、肾等脏器有无病变等,必要时作涂片和培养检查。

(4)剪开胸膛,用剪刀将胸部两侧肋部剪开,检查胸腔内有无渗出液及心、肺有无病变。取心血、心肺组织涂片和培养检查。

(5)解剖后的动物尸体应用厚纸包好焚烧或高压灭菌后掩埋。解剖器材用后应严格灭菌处理。

(四)动物采血

1.心脏采血常用于家兔和豚鼠,将动物仰面固定、消毒,选择用手触到心跳最明显部位,刺入心脏后血液立即涌出,至所需血量止。一般2000g左右体重的家兔一次可采血20 mL,豚鼠可采血5~10 mL,每2~3周可重复采血一次。

2.静脉采血常用于家兔和绵羊。找到家兔耳内侧静脉,消毒后,由外侧向内侧穿刺静脉,抽取所需血量。

【关键词】葡萄糖 葡萄球菌肠毒素 中国标准物质