稀释法是用培养基将抗菌药物作不同浓度稀释，再接种待检细菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死细菌的最低药物浓度的体外方法，分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。稀释法所测得的某抗菌药物能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最低抑菌浓度（MIC)。CLSI的M07文件系列对于MIC法给出了详细的标准。

（一）肉汤稀释法

肉汤稀释法包括常量稀释法（macrodilution）和微量稀释法（microdilution)。两者原理相同，只是反应液的体积不同。前者采用试管，每管中菌药混合物体积为2 mL；后者采用微孔板，每孔菌药混合物的体积为0.1 mL。

1．原理用MH肉汤将抗菌药物对倍稀释，接种一定量的待测菌，以肉眼看不见细菌生长的最低药物浓度为MIC；此方法定量测定抗菌药物杀灭受试菌的最低浓度为最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration,MBC)。

2．培养基MH肉汤为基础培养基，用于常规需氧菌和兼性厌氧菌检测。而相对苛养的细菌，如肺炎链球菌和流感嗜血杆菌检测则需要添加营养成分。虽然葡萄球菌不是苛养菌，但也需要添加2％（质量浓度）的NaCI以提高耐甲氧西林葡萄球菌的检出率。

3．药物稀释

(1)抗菌药物储存液的配制。抗菌药物干粉不能直接用于AST，一般保存在-20℃以下的干燥容器中。使用前先配制抗菌药物储存液，其浓度至少为1000 ug/mL（如1280ug/ML）或最高试验浓度的10倍。取少量体积的抗菌药物储存液于无菌玻璃、聚丙烯、聚苯乙烯或聚乙烯小瓶中，密封置于-60℃或更低温度，需要时解冻并且当天使用，用过的储存液应在24 h后丢弃。大多数的抗菌药物储存液可在-60℃或更低温度保存6个月或以上，其活性无显著变化。

(2)抗菌药物稀释液的配制。药物稀释液的浓度参考CLSI M100文件表格2的解释折点，实验室可根据实际调整。建议选择的浓度范围至少包括一种质控菌的折点。对药物储存液进行对倍稀释，其终浓度可为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 ug/mL（图10-3)。商业化的微孔板则已经在每孔中配制了不同抗菌药物浓度的肉汤，密封包装并置于-20℃（最好-60℃）以下温度保存。一经解冻后不能再重新冷冻，反复冻融会加速某些抗菌药物，特别是β-内酰胺类药物的降解。

图10-3肉汤稀释法的实验结果（待测菌的MIC为64 ug/mL)

4．细菌接种和培养采用直接菌落悬浮法或者肉汤培养生长法进行受试菌菌液的制备，然后用无菌生理盐水或肉汤调整受试菌的菌液浊度为0.5麦氏单位(1.5×10⁸CFU/mL)。在15 min内将校正好的菌悬液加入肉汤中，使每管或每孔的最终菌含量约为5×10⁵ CFU/mL。对于常量肉汤稀释法可以先将0.5麦氏单位的菌悬液作1:150的稀释，使每管含量约为1×10⁶ CFU/mL，然后向每一含有1 ml抗菌药物系列稀释管（阳性对照管仅加入肉汤）加入1 mL二并混匀，此时抗菌药液和菌液均为对倍稀释。每一批次实验均需要设立对照。对于大多数细菌的培养条件为35℃孵育16～20 h，某些细菌需要培养更长时间，如耐甲氧西林的葡萄球菌和脑膜炎奈瑟菌需要培养24 h，而某些苛养菌则需要5％的CO₂气体环境。

5．结果判断和解释肉眼所见试管内或微孔内能完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为该抗菌药物对受试菌的MIC。按照2012版CLSI的M07和M100补充文件，可根据细菌的MIC值判读AST的结果是敏感、中介或耐药，其依据来自于MIC与对应药物在血清中所能达到的浓度、特定的耐药机制以及药理疗效的研究。微量稀释法时，可采用比浊仪判断微孔板的孔内是否有细菌生长。多种商业化的微孔板可与自动化仪器配套使用，自动判断结果。

6．质量控制质量控制的要求类似于纸片扩散法，每次试验应使用规定的质控菌株。具体的标准参见CLSI的M07文件。

7．优缺点肉汤稀释法既可定性又可定量，不仅可判断细菌对药物敏感、中介还是耐药，还可以给出具体MIC数值。但操作较纸片扩散法烦琐。大多数情况下，检测细菌对药物敏感、中介还是耐药已经能够满足临床需要，因此，临床微生物实验室大多采用纸片扩散法进行AST。

（二）琼脂稀释法

琼脂稀释法是将抗菌药物均匀稀释于MH琼脂培养基中，配制出1:2、1:4、1:8等连续稀释或倍比稀释的平板，每一平板为一个药物稀释度，可采用多点接种仪接种细菌，孵育后观察细菌的生长情况，以点种处肉眼所见无细菌生长的最低平板药物浓度为MIC。

1．抗菌药物琼脂的制备 稀释药液加入45～50℃水浴平衡的MH琼脂中（药液和琼脂的体积比为1:9)，混合均匀后在水平台面倾注平板，使琼脂厚度为4 mm,避免产生气泡，室温下凝固。一种药物需要制备六个稀释度的平板，以及一个无药物的生长对照平板。倾注的平板可立即使用，或用密封袋储存于2～8℃。用于参考试验时保存时间不应超过5天，用于常规试验可保存更长时间。冰箱取出平板后应先平衡至室温，使用前需确保平板表面无水分。较为苛养的细菌需要在MH琼脂内添加补充物质。

2．细菌接种和培养将受试菌调整为0.5麦氏单位的菌悬液，现有的大多数多点接种仪可一次性在平板上接种32～36个标本，要求5～8 mm直径的接种点接种量为每点1×10⁴CFU。如接种针的直径为3 mm，每针接种的菌液体积则为2 uL(1～3uL)，需将0.5麦氏单位的菌悬液稀释10倍；若直径为1 mm，接种体积只有0.1～0.2uL，则不需要稀释菌悬液。菌悬液制备完成后应该在15 min内接种完毕。接种时注意接种点的方向，首先接种不含抗菌药物的生长对照平板，然后按照从低到高的药物浓度接种平板，最后接种第二个生长对照平板以验证在接种过程中无污染、针头没有携带抗菌药物｝待接种点完全干燥后（不要超过30 min)，置于35℃空气环境培养16～20 h。检测耐甲氧西林的葡萄球菌需培养24 h，较为苛养的细菌（淋病奈瑟菌、链球菌属、脑膜炎奈瑟菌等）需要5％的C0₂气体环境培养24 h。

3．结果判断和质量控制MIC的折点和解释同肉汤稀释法，结果可只报告MIC，也可只报告敏感、中介或耐药，或者两者皆有。每一批药物琼脂平板都应用质控菌株检测其是否合格，质量控制方面详见CLSI的M07文件。

4。优缺点琼脂稀释法可以同时进行多株细菌的MIC测定，结果重复性优于肉汤稀释法，且易于发现耐药突变株以及污染，是检验新药体外抗菌活性应参照的标准方法。由于操作烦琐，大多数实验室不采用此方法。然而，对于在肉汤中生长不良的淋病奈瑟球菌，AST采用琼脂稀释法则优于肉汤稀释法。