（一）检验程序

结核分枝杆菌的检验程序见图21-1。

图21-1结核分枝杆菌的检验程序

（二）标本采集

标本的选择应根据感染部位而异，可取痰、支气管灌洗液、尿、粪、脑脊液或胸腔积液、腹腔积液、分泌液或组织细胞。结核患者各感染部位的标本中大多数混有其他细菌，因此，必须采取适宜的方法抑制污染菌。

痰收集最好是患者清晨的第一口痰，置于清洁干燥无菌的玻璃瓶内送检。尿液收集应取晨尿送检，必要时作无菌导尿送检，诊断泌尿道结核通常需3～5份标本。胃液采集可于空腹时抽取，置无菌管中送检。脑脊液、胸腔积液、腹腔积液及关节液等需无菌抽取并置于无菌试管中送检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取凝块作涂片或接种培养。采集脓液时应直接从溃疡处取脓汁或分泌物。深部脓肿用无菌注射器抽取，置无菌试管中送检。棉拭子采集的标本应直接放置在肉汤中培养。

（三）鉴定试验

1.形态学检查

(1)直接涂片染色镜检：用接种环取患者痰液中浓厚部分或离心沉淀的尿沉淀物2～3接种环涂片，作厚涂片进行齐-尼抗酸染色。为提高镜检敏感性，也可用金胺“O”染色，在荧光显微镜下结核分枝杆菌呈现金黄色荧光。

镜检时应仔细查遍整个涂片或观察至少100个视野。结核分枝杆菌抗酸染色后呈红色，其他细菌和细胞为蓝色。经免疫荧光染色的结核分枝杆菌，在黑色背景中呈亮黄色。涂片镜检结果应报告“找到抗酸杆菌或未找到抗酸杆菌”。其具体报告方式如下。
直接涂片法可用Gaffky报告法，也可按照1984年国内统一暂行规定的厚涂片法报告方式填写报告，图片镜检的报告方式见表21-1。

表21-1图片镜检的报告方式

(2)浓缩集菌涂片检查：集菌后检查可提高检出率。脑脊液和胸腔积液、腹腔积液无杂菌，可直接离心沉淀集菌。痰、支气管灌洗液、尿、粪等污染标本需经4％ NaOH(痰和碱的比例为1:4，尿、支气管灌洗液和碱的比例为1:1)处理15 min，时间过长易使结核分枝杆菌L型与非结核性分枝杆菌死亡。尿标本先加5％鞣酸、5％乙酸各0.5 mL于锥形量筒内静置，取沉淀物处理后的材料再离心沉淀。集菌后标本经多次涂片（厚片），涂抹面积的直径大约为15 mm即可，干燥、固定后染色镜检。

2.分离培养脑脊液、胸腔积液、腹腔积液等无杂菌污染的标本可直接或离心后取沉渣接种。有杂菌的标本（如痰和尿液等）经碱处理，再用酸中和，离心沉淀后培养。

(1)固体培养基培养法：常用罗氏培养基或青霉素血液琼脂培养基，37℃,5％～10％CO₂培养8周，每周观察1次，如出现生长缓慢、干燥、呈颗粒状、灰白色菌落，抗酸染色为阳性，则多数是结核分枝杆菌。若涂片结果为阴性或菌落有色素产生，同时菌落形态不典型，需将接种物于24～33℃继续培养至12周。

(2）液体培养法：将集菌材料滴加于含血清的培养液（常用米氏7H9和Dubos吐温白蛋白肉汤），于1～2周在管底可见有颗粒生长。取沉淀物作涂片、染色镜检，并进一步作生化、药敏等测定以区分结核分枝杆菌与非结核性分枝杆菌。20世纪70年代以后，微生物学家和工程技术人员创立了包括应用14C标记技术的半自动快速培养系统（Bactec-460)、全自动分枝杆菌快速培养系统（MB/BacT）等分枝杆菌的快速培养方法，在分离率、报告速度和操作方便程度等方面均有很大提高。阳性瓶中经涂片确认为分枝杆菌后应做NAP(p-nitro-a-acetylamino-p-hydroxy-propiophenome）抑制试验。NAP能抑制结核分枝杆菌的生长，由此可区分结核分枝杆菌与非结核性分枝杆菌。同时还可使用基因技术鉴定菌种。国内学者已证明结核分枝杆菌L型可存在于血细胞内或黏附于细胞表面，患者往往血沉加快，血液标本应采用低渗盐水溶血，离心后立即接种于高渗结核分枝杆菌L型培养基，能提高培养阳性率。

3．生化反应结核分枝杆菌不发酵糖类。与牛分枝杆菌的区别在于结核分枝杆茵可合成烟酸和还原硝酸盐，而牛分枝杆菌不能。热触酶试验对区别结核分枝杆菌与非结核性分枝杆菌有重要意义。结核分枝杆菌大多数触酶试验阳性，而热触酶试验阴性；非结核性分枝杆菌则大多数两种试验均阳性。

4．基因诊断

（1） PCR反向膜探针杂交ELISA法（PCR杂交）：该法是将PCR、分子杂交、酶联免疫显色三种技术有机结合，经过两次特异性双向选择，其特异性相互补充和加强，对提高本方法的特异性、消除假阳性起到了决定作用。

(2) DNA探针：使用对分枝杆菌rRNA序列特异的DNA探针与分枝杆菌rRNA杂交。由于每个结核分枝杆菌细胞内有10000个rRNA拷贝，故为杂交提供了一个天然的放大系统，提高了检测的灵敏度。同时可将荧光素、同位素或生物素标记在探针上，通过检测荧光或放射性等来鉴定菌种。

(3) 16S rRNA基因序列测定：由于结核分枝杆菌的16S rRNA基因序列是高度保守的，具有种特异性，可通过测定16S rRNA基因序列来鉴定结核分枝杆菌。

5．免疫学诊断

(1)抗原检测：用ELISA方法检测血清中的结核分枝杆菌抗原，2h内可检测并定量分析结核分枝杆菌外分泌的特异性抗原（external secreted specific antigen）的浓度，快速确定是否感染结核分枝杆菌，其准确度达90％以上。

(2)抗体检测：用ELISA法检测患者血清中抗PPD IgG，可作为活动性结核分枝杆菌感染的快速诊断方法之一。肺结核患者血清阳性率为80％～90％。

(3）结核菌素试验(tuberculin test, TST)。

①原理：以往用旧结核菌素（old tuberculin, OT)，是将结核分枝杆菌接种于甘油肉汤培养基，培养4～8周后加热浓缩过滤制成。稀释2000倍，每0.1 mL含5U。目前采用纯蛋白衍化物（purified protein derivative, PPD)。PPD有两种：人结核分枝杆菌制成的PPD-C和卡介苗制成的BCG-PPD。每0.1 ML含5 U。

②方法：取0.1 ml, PPD或OT注射于前臂掌侧皮内，48～72 h后，检查注射部位的变化。应特别注意局部有无硬结，不能单独以红晕为标准。

③结果分析：注射部位硬结、红肿直径在5～15 mm之间为阳性，表明机体曾感染过结核分枝杆菌，出现超敏反应，但不表示正患结核；硬结直径超过15 mm为强阳性，表明可能有活动性结核，应进一步检查；注射部位有针眼大的红点或稍有红肿，硬结直径小于5 mm为阴性，说明无结核感染。但应考虑下述情况：感染初期，因结核分枝杆菌感染后需4周以上才能出现超敏反应；老年人、严重结核患者或正患有其他疾病，如麻疹、AIDS导致的细胞免疫功能低下、肿瘤患者或用过免疫抑制剂者。为排除假阴性，国内有的单位加用无菌植物血凝素（PHA）针剂，0.1 mL含10 ug做皮试。若24 h红肿大于PHA皮丘者为细胞免疫正常，若无反应或反应不超过PHA皮丘者为免疫低下。

④应用：选择BCG接种对象及测定接种效果。结核菌素反应阴性者应接种BCG；结核菌素试验可对婴幼儿结核进行辅助诊断；在未接种BCG的人群中作结核分枝杆菌感染的流行病学调查；测定肿瘤患者的非特异性细胞免疫功能。

(4)γ-IFN释放试验：细胞免疫介导的结核分枝杆菌γ-IFN释放试验（T-cell interferon gamma release assays, TIGRA，又称IFNGRA或GRA）是近年来采用酶联免疫吸附试验（ELISA）或酶联免疫斑点（enzyme-linked immunosorbent spot, ELISPOT）法定量检出受试者全血或外周血单核细胞对结核分枝杆菌特异性抗原的γ-IFN释放反应，可用于结核分枝杆菌潜伏感染的诊断。γ-IFN为Thl细胞分泌的一种细胞因子，不但能够反映机体的Thl细胞免疫情况，还与体内结核分枝杆菌的抗原含量密切相关。被结核分枝杆菌抗原致敏的T细胞再次遇到同类抗原时能产生高水平的γ-IFN，因此，该试验用于结核分枝杆菌潜伏感染的诊断。

6．气-液相色谱（GLC)的高压液相色谱（HPLC)分析可分析不同分枝杆菌脂肪酸的类别。

（四）药物敏感试验

将分离的结核分枝杆菌纯培养物制备成菌悬液，接种于含不同浓度药物的固体培养基上，同时做不含药物的对照组、经过培养，含有药物的培养基上菌落数目是对照组的75％以上时，则认为该菌对该药物浓度为完全耐药，如无菌落生长则为敏感。结核分枝杆菌耐药菌株的日益增多使结核成为威胁人类健康的一个新的严峻事实。近年来，有2/3以上临床分离的结核分枝杆菌具有多重耐药性，因此，对临床分离的结核分枝杆菌应做药物敏感试验，以指导临床合理用药。