一、标本采集与运送

标本的采集与运送是否符合要求，是厌氧菌培养成功的关键。进行厌氧菌检验，采集标本时要确保标本不被正常菌群污染，同时应尽量避免接触空气。

用于厌氧菌培养的最佳标本是活检组织或用针筒抽取的分泌物及脓液。尽量不用棉拭子标本。标本采集后应尽快送检，厌氧菌标本的运送方法主要有如下几种。

1．无氧小瓶运送法这为目前常用的方法，可用于少量脓液、体液等液体标本的运送。

2．厌氧袋运输法在患者床边用预还原的厌氧血琼脂平板接种所采集的标本，然后立即将平板放入厌氧袋后及时送实验室培养。

3．针筒运送法用无菌空针筒抽取液体标本后排尽空气，并将针头插入无菌橡皮塞中即可送检。由于存在被针头刺伤的危险，该法已不提倡使用。

4．其他运送法除以上方法外也可用标本充盈法、组织块运送法、棉拭子运送法等。

标本送到实验室后，应在20～30min内处理完毕，最迟不超过2h。如不能及时接种，可将标本置室温保存，不宜4℃冷藏，因冷藏对有些厌氧菌有害。

二、检验程序

厌氧菌的检验程序见图23-1。

图23-1厌氧菌的检验程序

三、检验方法

（一）标本直接显微镜检查

收到临床标本应先观察其性状，包括气味，是否为脓性、带血、黑色分泌物，有无黑色坏死组织及紫外灯下有无荧光等。除血液外，各种标本在接种前均需直接涂片、革兰染色镜检，观察细菌的形态及染色特性，并初步估计标本中大致的含菌量，结合肉眼和镜下结果选择合适的培养基、进一步检查，及时将结果通知临床医生以指导合理用药。

（二）分离培养

临床标本中厌氧菌的初代培养比较困难，不仅要为厌氧菌生长提供适合的厌氧环境，还要使用营养丰富的培养基。

1．培养基的选择用于厌氧菌分离的培养基包括非选择性培养基和选择性培养基。在初代分离厌氧菌时除接种非选择性培养基外，还要根据标本中可能含有的厌氧菌种类，接种适当的选择性培养基，以提高厌氧菌的检出率，防止漏检。

培养基应保持新鲜，最好当天配制或使用前24 h置于无氧环境使其预还原，或使用预还原灭菌法制备的培养基；液体培养基在使用前应煮沸10 min，以驱除溶解氧，并迅速冷却立即接种。

在临床厌氧菌感染中，常与需氧菌或兼性厌氧菌混合感染，初代培养时，标本一般应同时接种于普通血琼脂平板、厌氧血琼脂平板、巧克力琼脂平板和相应的选择性培养基，分别置于有氧、无氧和含5％～10％CO₂,环境进行培养，以防止漏检。同时还应接种一支液体培养基，用于增菌和保存标本。为便于在混合培养物中发现厌氧菌，标本分三区划线接种于厌氧血琼脂平板，在一、二区交界处，贴一张甲硝唑纸片，如纸片周围出现抑菌圈，表明有厌氧菌存在。

2．培养方法厌氧培养方法很多，常用的有厌氧罐（盒）培养法、厌氧气袋法和厌氧手套箱法。

(1)厌氧罐（盒）培养法：具有设备简单、操作方便、所占空间小等特点，是国内普遍采用的方法。其原理是采用一个密闭的罐子（或塑料盒），通过物理或化学方法除去罐内氧气，造成无氧环境。常用方法有冷触媒法和抽气换气法。

(2)厌氧气袋法：用无毒的塑料薄膜制成的特殊气袋代替厌氧罐，采用冷触媒法使袋内形成无氧环境。此法简便易行、携带方便，既可用于标本运送，也可用于标本接种后的培养，尤其适合床边接种。

(3)厌氧手套箱法：目前国际上公认的厌氧菌培养的最佳设备，是一个密闭的大型金属箱，通过自动化装置自动抽气、换气，保持箱内始终处于无氧状态。操作者可以通过培养箱前面附带的橡胶手套在箱内操作，在无氧环境中进行标本的接种、培养和鉴定等全部工作。

大多数厌氧菌在初代培养时生长较慢，故厌氧培养在37℃至少培养48 h，若培养48 h肉眼仍无生长现象，但直接镜检阳性，应继续培养5～7天。当厌氧培养有细菌生长时必须做耐氧试验，以确定是否为厌氧菌：

（三）鉴定

当确定为厌氧菌并纯化后，再根据菌落性状、菌体形态、染色特征等试验结果对部分厌氧菌的种、群或属作出初步鉴定，以满足临床常规检测目的。

1．形态与染色能反映各种厌氧菌的特殊形态，可为厌氧菌鉴定提供参考依据。但厌氧菌的染色特性易受培养基的种类及培养时间的影响，某些菌种可由革兰阳性变为革兰阴性而不易判断。此时可用拉丝试验协助判定，加30g/L、的氢氧化钾溶液一滴于载玻片上，取待测菌与之混合，1 min后用接种环轻轻挑起，能拉起丝的为革兰阴性菌，反之，为革兰阳性菌。

2．菌落性状菌落的形状、大小、色素、荧光以及溶血现象等对厌氧菌的鉴定具有重要的参考价值。

3．生化试验包括多种糖类发酵试验.吲哚试验、硝酸盐还原试验、硫化氢试验、明胶液化试验、蛋白溶解试验、胆汁肉汤生长试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂酶试验等。目前用于厌氧菌快速鉴定的胞外酶试验，利用厌氧菌在代谢中产生的酶与少量的生化基质迅速反应，不需要厌氧培养，只需少量浓菌液，4h即可观察结果。

4．气液相色谱技术厌氧菌在代谢过程中能产生较多的挥发性短链脂肪酸、非挥发性有机酸及醇类等代谢产物，并且其代谢产物的种类和含量因菌种不同而异，应用气液相色谱技术进行分析可鉴定厌氧菌。也可利用气液相色谱技术直接分析临床标本中的厌氧菌，经数十分钟至数小时即可作出诊断。本法快速简便、准确可靠、样品用量少，是一项先进的分析技术，可用于厌氧菌鉴定及分类。

5．其他鉴定试验抗生素敏感性鉴定试验、聚茴香脑磺酸钠（Sodium polyanetholes ulfonate,SPS)敏感试验、PCR和基因探针等方法也可用于厌氧菌的鉴定。