北京普天同创生物科技有限公司
应用色谱法的目的是分离分析,因此首先要考虑混合物的分离。色谱法的分离性能较蒸馏法、萃取法等其他分离方法优越得多,尤其在分离沸点相近的化合物、共沸化合物或结构类似的化合物方面更具优越性。此外,色谱法还具有检测灵敏度高、样品量少以及能检测极微量组分等优点。
现在常用的是气相色谱法、薄层色谱法和液相色谱法,一般根据分析的目的或样品性质等分别单独或组合使用这些方法。为灵活有效地应用这些方法,必须充分掌握各种色谱法的特点和适用条件。
一.样品的前处理和衍生化
1.样品的前处理
样品有气体、液体和固体等各种形式。用色谱法分析这些样品时,首先必须明确样品的性质和特点,详细了解待测样品的制取过程、前处理方法、样品的物理性质和化学性质等。
用色谱法分析混合物时,经常要求对样品进行前处理。对成分复杂的混合物,即使本身适于色谱分析,但由于固定相、流动相等分析条件的限制,也难以充分分离。在这种情况下,应预先进行蒸馏、萃取和过滤等前处理,然后再使用色谱方法。气相色谱一般通过蒸馏等除去不挥发性成分,而液相色谱则通过脱气、过滤除去低沸点成分或固体成分。前处理不仅能提高分离性能,而且对延长色谱柱寿命和防止色谱仪器装置发生故障也很有效。
例如,分析生物样品或水中的多氯联苯(PCB)时,样品需经高纯度正己烷萃取、碱化等前处理之后,再浓缩并用气相色谱法分析。
2.样品的衍生化
进行上述蒸馏、萃取等必要的前处理之后,用气相色谱法、液相色谱法、薄层色谱法等进行分析。为提高样品的挥发性、热稳定性或检测灵敏度,有时还须在样品分子结构中引入特殊官能团、变成衍生物之后再进行测定。例如,在气相色谱中,常把含有羟基、羧基和氨基的难挥发性样品变成三甲基硅醚(TMS)衍生物、酯类衍生物和三氟乙酸酯衍生物以提高挥发性;为提高类固醇等物质的热稳定性,将其变成肟类衍生物后再测定等。
二.根据样品状态选择色谱方法
表5-2列出了根据样品状态采用的色谱方法和适用样品。对于挥发性、热稳定性好的化合物,一般采用气相色谱法,利用各种固定相,可以分析以碳氢化合物为代表的多种有机化合物。
表5-2根据样品状态采用的色谱方法和适用样品
液相色谱法或薄层色谱法常用来分析不适于用气相色谱法分析的难挥发的不稳定化合物或高分子化合物、离子型化合物等。高效液相色谱法已广泛用于医药、农药等与生物化学有关的样品分析。
液相色谱法还建立了在分离之前使各成分与荧光物质反应,用荧光检测器做极微量分析的方法。
三.根据分析目的选择色谱法
根据样品的形态、成分的种类和含量进行必要的前处理后,可选择最适合分析目的的色谱方法。这时,必须仔细考虑定性分析、定量分析、欲分析成分的种类和数量、分析精度及分析时间等问题,然后再选择最适合的色谱分析方法。定性分析时,用气相色谱的保留时间与色谱图上峰的位置对化合物进行鉴定。但是,此法不宜分析含有未知结构的组分的样品,这类样品必须用气相色谱-质谱联用法等进行鉴定。用气相色谱-质谱联用法也不能鉴定时,应分别收集色谱分离后的各个成分,借分析其红外、质谱和核磁共振波谱等进行鉴定。但收集液相色谱、薄层色谱分离后的成分进行鉴定时,必须除去溶剂。用各色谱图的峰面积或峰高进行定量分析。在色谱分析中,应根据分析对象选择适当的检测器。不同的色谱方法具有不同的检测特点和选择方法。各种色谱法的检测器或检测法及其特征见表5-3。
表5-3各种色谱法的检测器或检测法及其特征
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