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高效液相色谱法基本原理

发布时间:2017-10-08 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:5338

一.固定相和流动相

1.固定相

HPLC固定相按其所能承受的高压的能力范围,可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以SiO2为基质,可承受较高压力,在其表面可以键合各种功能官能团,称为化学键合固定相,是目前应用最广泛的固定相。硬胶主要用于离子交换和凝聚色谱法中,它由聚苯乙烯二乙烯基苯交联而成,可承受的压力较低。

固定相按孔隙深度又分为表面多孔型(薄壳型)和全多孔型。表面多孔型的基体是球形玻璃珠,在玻璃表面包覆一层数微米厚的多孔活性物质如硅胶、氧化铝聚酰胺、离子交换树脂、分子筛等,直径为25~70um。也可以制成化学键合固定相,这种固定相的多孔层薄、传质速率快、柱效高,适用于快速分离;填充均匀紧密、机械强度高、能承受高压的情况,适合于较简单的样品及常规分析;但由于多孔层薄,进样量受限制。全多孔型固定相由硅胶颗粒凝聚而成,一般制成筛分很窄(1um到几微米)、颗粒很小(5~10um)的全多孔微球型或非微球型。全多孔型固定相比表面积大,柱容量大,小颗粒全孔型固定相(直径为10um)孔洞浅,传质速率仍很快,柱效高,分离效果好,适合于复杂样品、痕量组分的分离分析,是目前HPLC中应用最广泛的固定相。

2.流动相

液相色谱中的流动相,也称溶剂,由洗脱剂和调节剂两部分组成。前者的作用是将样品溶解和分离,后者则用以调节洗脱剂的极性和强度,以改变组分在柱中的移动速度和分离状态。

由于HPLC中流动相是液体,它对组分有亲和力,并参与固定相对组分的竞争。因此,正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相的基本要求如下。

1)所选用的流动相稳定性好,不与固定相互溶,不发生不可逆作用,不与样品组分发生化学反应,保持柱效或柱子的保留值性质较长时间不变。

2)择性好,对待测样品有足够的溶解能力,以提高测定的灵敏度。

3)与所用检测器相匹配,如应用紫外吸收检测器时,不能用对紫外光有吸收的溶剂。

4)黏度尽可能小,不干扰样品的回收,以获得较高的柱效。

5)纯度要高。不纯溶剂会引起基线不稳,或产生“伪峰”。溶剂中痕量杂质的存在,长期积累会导致检测器噪声增加,同时也影响收集的馏分纯度。

6)价格适宜,不污染环境和腐蚀仪器。

色谱分析中,流动相选择时虽然有极性、结构相似相溶的规则可循,但多数仍带有一定的经验性。一般情况下,要使样品分离得好,容易洗脱,样品和流动相就应具有化学上的相似性。也就是说,极性大的样品,选用极性大的流动相;极性小的样品,选用极性小的流动相。对于在正相色谱法中分离时间较长或难以分离的样品,可改用强极性的流动相和弱极性固定相的反相色谱法进行。有时,为了获得溶剂强度(极性)适当的流动相,往往需要经过反复多次实验,或采用两种以上的混合溶剂作流动相。

在HPLC分离的过程中,为分离复杂的混合物,将两种或两种以上的溶剂,随着时间的改变按一定的比例混合,以连续改变流动相的极性、pH或离子强度,使之改变被分离组分的相对保留值,以提高分离效果和加快分离速度,这种方法称为梯度洗脱法。其相应的装置就叫梯度洗脱装置。

二.常用术语和参数

在HPLC中,许多术语和参数与GC相同,下面为HPLC中特有的一些术语和参数。

1.与体积有关的参数

与体积有关的参数的表示方法几乎与GC完全相同,只有个别地方略有差异。在HPLC中没有比保留体积(Vg)和保留指数(I)的概念,而有一些独立的参数。

1)粒间体积(Vo):色谱柱填充剂颗粒间隙中流动相所占有的体积。

2)多孔填充剂的孔体积(VP):色谱柱中多孔填充剂的所有孔洞中流动相所占有的体积。

3)柱外体积(Vext):从进样系统到检测器之间色谱柱以外的液路部分中流动相所占有的体积。

4)液体总体积(Vtot):粒间体积、孔体积和柱外体积之和:

Vtot=V0+VP+Vext                                  (7-1)

5)淋洗体积(Ve):从进样开始计算的通过色谱柱的实际淋洗体积。

6)流体力学体积(Vh):每摩尔高分子化合物在溶液中运动时所占的体积,与高分子化合物的相对分子质量和特性黏度的乘积成正比。

2.与柱效有关的参数

大部分参数的表示方法和GC相同,如表示柱效率的理论板数(n)、理论板高(H)、有效板数(neff)等,但在HPLC中也有如下一些特有的参数。

1)折合板高(hr):折合成固定相单位粒径的理论板高。

2)折合流动相速度(Vr):

(7-2)

式中,u为流动相的平均线速度,cm/s;dp为填充物颗粒的平均直径,cm;Dm为被测组分在流动相中的扩散系数。

三.原理介绍

HPLC是将经典液相色谱法与气相色谱法的基本原理和实验方法相结合而产生的。GC的基本概念、保留值与分配系数的关系、塔板理论及速率理论都可应用于HPLC,所不同的是流动相的性质。因此两者在某些公式的表现形式或参数的含义上有些差异。

在HPLC中,液体流动相的相对分子质量要比GC中的气体流动相的相对分子质量大得多,由于被测组分在流动相中的扩散系数Dm与流动相的相对分子质量成反比,因此速率方程(van Deemter方程)中的分子扩散项B/u较小(B=2rDm,r反映出在填充柱内固定相颗粒的几何形状对流动相分子扩散所产生的阻碍情况,即代表流动相在填充柱内扩散路径弯曲的因素,也称为弯曲因子),可以忽略不计,于是van Deemter方程式在HPLC中的理论板高(H)为

H=A+Cu                                 (7-3)

式中,A,C为常数;A为涡流扩散系数;C为传质阻力系数,Cu为传质阻力项;u为流动相的平均线速度,cm/s。

式(7-3)说明,在HPLC中,可以近似地认为流动相的流速与塔板高度呈直线关系,A为截距,C是斜率。流速增大,塔板高度增加,色谱柱柱效降低。为了兼顾柱效与分析速度,一般都尽可能地采用较低流速。内径采用4.6 mm的色谱柱,流速多采用1mL/min。

HPLC与GC两者的H-u曲线的形状不同,如图7-1所示。

图7-1流动相的流速对GC与HPLC柱效影响对比

1-B/u;2-Cu; 3-A;4-HPLC的u最佳;5-GC的最佳

图中u最佳指的是综合考虑液相色谱仪的运行成本及效率因素,流动相在色谱柱中流动时的最佳平均线速度,cm/s; B/u为分子扩散项,其中B为常数,u为流动相的平均线速度,cm/s ; Cu为传质阻力项。

谱带扩张是指由柱内外各种因素引起的色谱峰变宽或变形,使柱效降低的现象。在HPLC中,主要由以下因素引起。

(1)涡流扩散

涡流扩散是由于柱中存在曲折的多通道,使流动相流动不均匀所引起的。其中A=2λdp,式中,λ为填充不规则因子;dp为填充物颗粒的平均直径。为了使A减小,提高色谱柱柱效,可从两方面采取措施。①降低粒径(dp)。采用小粒径固定相,粒径越小,A越小。以前多用l0um粒径的固定相,目前商品柱多采用3~5 um粒径的固定相。②降低λ。采用球形、窄粒度分布(RSD<5%)的固定相及匀浆装柱。球形固定相除了能降低入外,还能增加柱渗透性,降低柱压。但固定相的粒度越小,越难装均匀,因此须采用高压匀浆装柱法。3~5um球形固定相,柱效一般为(5~8)×104/m,最高可达1×105/m。

(2)传质阻力

传质阻力是指在同一流路中各部位的不同流速造成分子纵向扩散,由此引起的谱带扩张。因为当流动相在柱中流过时,靠近颗粒表面的流速比流路中间的流速要慢,甚至不流动。结果在一定的时间里,靠近颗粒表面的分子所扩散的距离比中间的要短,引起了分子在柱内的扩散分布不均。流动相传质引起的谱带扩张使柱效降低。传质阻力项为Cu。在HPLC中传质阻力系数(C)由Cm,Csm和Cs三个系数组成,

C=Cm+Csm+Cs                                  (7-4)

式中,Cm为组分在流动相中的传质阻力系数;Csm为组分在静态流动相中的传质阻力系数;Cs为组分在固定相中的传质阻力系数。

在填充气相色谱柱中,固定液的传质阻力起决定作用,因此C=Cs。而在HPLC中,只有在使用厚涂层并具有深孔的离子交换树脂的离子交换色谱法中,Cs才起作用。由于通常都采用化学键合相,它的固定液是键合在载体表面固定液官
能团的单分子层。因此,固定液的传质阻力可以忽略。于是

C=Cm+Csm                                  (7-5)

于是,van Deemter方程式用于HPLC最常见的表现形式为

H=A+Cmu+Csmu                                 (7-6)

式中,H为理论塔板高度,cm;A为涡流扩散系数;u为流动相的平均线速度,cm/s。

式(7-6)说明,HPLC色谱柱的理论塔板高度,主要由涡流扩散项、流动相传质阻力项和静态流动相传质阻力项三项构成。

根据应用于HPLC的van Deemter方程,HPLC分离操作条件主要包括以下几方面:①采用小粒径、窄粒度分布的球形固定相,首选化学键合相,用匀浆法装柱。②采用低戮度流动相,低流速(1mL,/min)。③柱温一般以25~30℃为宜。柱温太低,则使流动相的黏度增加,柱温太高易产生气泡。用不含有机溶剂的水溶液为流动相的色谱法(如IEC,IC等)可按需升温。

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