一.质谱在生物大分子中的应用

1．多肽和蛋白质的质谱分析

(1)多肽和蛋白质的一级结构

蛋白质作为生命活动的物质基础，广泛存在于生物细胞中且占细胞干质量的50％以上，是生物体内含量最高、功能最重要的一类生物大分子。关于它的结构分析是生命科学的重要课题，而质谱法在这方面越来越显出威力，也越来越引起人们的重视。

组成蛋白质的基本单元是氨基酸，虽然蛋白质种类繁多，但是所有蛋白质都是由20种基本氨基酸构成的。重要氨基酸的名称及相对分子质量见表10-8。蛋白质作为由一条或多条多肽链以特殊方式组合的生物大分子，其结构主要是以肽链结构为基础的肽链线型序列组成，称为一级结构，以肽链卷曲、折叠而形成的三维结构组成称为二级、三级或四级结构。目前质谱分析在蛋白质方面的检测主要是测定蛋白质的一级结构，所能获得的较多的信息主要为相对分子质量、肽链中的氨基酸排列顺序以及多肽键或二硫键的数目和位置。

表10-8常见氨基酸

虽然用质谱法分析蛋白质的高级结构是可能的，且这方面的研究正在展开，但方法尚不够成熟。

(2)多肽和蛋白质的分子质量测定

20世纪80年代，Barber等以甘油为基质首先利用FAB双聚焦质谱仪测定十一肽(Met-Lys-bradykinin,Mr=1318)的分子质量，结果在质谱峰中发现准分子离子[M+1]+=1319的强峰。经分析，该肽链在测试中均为单电荷离子，如肽离子、甘油离子和甘油簇离子等。一般FAB质谱测试中常用Ar作轰击剂，在某些特殊情况下也可以用Xe代替Ar。此外FAB质谱法可以测正负离子谱，但是受蛋白质或多肽分子中含有氨基、羟基多个易质子化部位的影响，一般都是在正离子模式下测其谱图。基质中可以加入少量的有机酸，如甲酸、乙酸等，用以增强［M+1]⁺离子强度，如3-硝基苄醇或其辛酯，或N-甲酰-2-氨基乙醇。测取负离子谱时则采用碱性液体作基质，如三乙醇胺，这样的基质有助于样品分子中酸性部位脱去质子。

虽然FAB质谱可以分析混合肽，但是必须注意疏水性较强的肽比亲水肽更容易电离，使后者的讯号被完全压制而测不出来。所以在进行FAB质谱分析之前最好将混合肽用反相HPLC分级，虽然每一级仍然是一个肽的混合物，但是不会在同一流出部分中同时含疏水性肽和亲水性肽（至少不会含同样大小的这些肽）。

分子质量小于6000Da的肽或小蛋白质用FAB质谱分析是合适的，但是分子质量≥6000Da的多肽和蛋白质比较适合采用MALDI质谱或EST质谱。因此FAB质谱只适用于分析酶水解或化学降解的蛋白质或人工合成的寡肽。虽然FAB质谱与色谱（HPLC或毛细管电泳）联用的研究早有报道，但不及ESI-MS和HPLC色谱联用方便。

对于用MALDI-TOF质谱分析蛋白质，早在1988年Hiukamp等就在实验室以烟酸为基质，利用紫外激光测出质量数高达61 000Da的蛋白质。当时MALDI-TOF质谱的精确度只有±0.5％，目前可以达到±0.l％～±0.2％。曾报道用355nm激光照射芥子酸为基质，用已知分子质量的蛋白质为内标，测得分子质量小于30 000Da的蛋白质，精确度达±0.01％。因此，MALDI-TOF质谱仪因上限高、灵敏高、反应快（＜1min)而被广泛应用于蛋白质分析检测中。

后来发现MALDI中也采用红外激光，如用10.6nm的激光照射，并显示出IR激光可能优于UV激光。最先采用MALDI技术时，主要是用于测定高质量大分子蛋白质，其实此技术也能很好地用于测定小分子蛋白质。其下限由基质离子族背景决定，如用芥子酸作基质时下限约为m/z 1000，用2,5-二羟基苯甲酸时为m／z500。因此，在此下限以上，MALDI可用于分析不同分子质量的蛋白质混合物，如酶解蛋白。MALDI质谱比FAB质谱所测上限高、操作迅速方便，并且对亲水多肽峰的压制小。MALDI-TOF质谱的不足之处是分辨率较低（不能分辨同位素多重峰）、质量精度较低、灵敏度低。但这些缺点已为近年来关于MALDI-TOF仪器和机制的研究成果逐步克服。MALDI与离子回旋共振质谱（傅里叶变换质谱，FT-MS)联用则能更好地解决这些问题。

EST质谱应用于蛋白质分析检测中也有悠久的历史，1988年，Fenn课题组成功地用EST质谱分析了多电荷离子群蛋白质大分子，当时并未发现单电荷蛋白质大分子。依据经验，在EST源模式下，多肽或蛋白质分子因结合质子大都是带正
电荷的，这是由多肽或蛋白质分子中所含碱性氨基酸总数和N端氨基决定的。同时所带电荷数目及分布也受测试条件影响，如溶液体系的pH、变性剂的存在、温度等。例如，牛细胞色素C的EST质谱图中，丰度最大的离子在电喷雾溶液pH为5.2时带有10个正电荷，在pH为2.6时带有16个正电荷。

EST质谱测出的相对分子质量精度较高，原因之一是所测出的数值是各多电荷离子计算出的相对分子质量数值的平均值。雌马肌红蛋白（equine myoglobin)的EST质谱中有12个多电荷离子（13⁺～24⁺），由它们的m/z值计算出的相对分子质量（Mr）为16 951.7，而实际值为Mr=17 000，用其分析两种蛋白质软骨素酶Ⅰ和Ⅱ(chondroitinaseⅠ和Ⅱ),谱图中同位素峰分布规律清晰可辨，测出的Mr数值与DNA法导出的数值很接近，表明其精度优于其他方法，结果见表10-9。

表10-9雌马肌红蛋白ESI质谱离子质荷比及相对分子质量