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LC-MS的应用及相关技术定量分析

发布时间:2017-10-18 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1106

1.定量分析的评价

任何一种仪器技术,都必须同时具备定性分析和定量分析的功能,才可被认为是一种完整的分析技术,LC-MS也是一样。目前的仪器设计所达到的重现性和线性范围指标可以满足一般的定量分析的精度要求。

1)重现性。利血平纯品10pg,以FIA方式在1h内连续40次进样,SIM模式采集,以峰面积进行定量,所得峰面积的百分标准偏差为:外标法SD<1.35%,内标法SD<0.84%。

2)线性范围。咖啡因10~50mg, SIM模式采集,采集离子m/z 195,C18反相柱分离,水-乙腈(85,15,体积比)0~8mL/min,r=0.985。

2.定量分析实例

以辛伐他汀为例,进行定量分析。辛伐他汀为甲基羟戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶抑制剂,临床上可用于冠心病和高胆固醇血症的治疗或辅助治疗。辛伐他汀具有较强的副作用,其药物代谢动力学的研究及临床用药都需要进行测定和监控。由于辛伐他汀的血药浓度较低(2~4ng/mL),需采用高灵敏度的测定方法。已报道的辛伐他汀的定量分析方法有荧光检测的HPLC方法(衍生化)、GC-MS负CI方法和GC-MS-MS方法。

以HPLC-MS建立的辛伐他汀血浆浓度定量方法为例歹该方法以C8硅胶固相萃取柱为主要分离手段,以辛伐他汀的同系物洛伐他丁为内标,萃取液浓缩后进样分析,检测限可达0.3 ng/mL血浆(>2倍噪声),在0.3~20ng/uL的浓度范围内内标校正曲线具有良好的线性关系(r=0.997)。

由以上数据可看出,LC-MS的定量精度与GC-MS基本相当。当然,非定量方法的评价由于不同的对象和不同的样品基质很难作出一个具有概括性的结论,因此上述例子只能作为一般性参考。

与GC-MS相比,LC-MS定量在于它的分析速度和相对简单的前处理。这表现在:①大多数样品无须衍生化;②液相柱的样品出峰时间较短,一般可以调整几分钟,而GC-MS分析中仅溶剂延迟时间就要lmin左右,如果是单一组分或2~3个组分的同时定量,则一个样品的LC-MS定量分析可以在几分钟内完成,这比较适合于进行批量样品分析的实验室。

LC-MS定量中要解决的主要问题仍是化学基质和生物学基质的干扰,这也是所有定量和定性分析中,在提高精确度和灵敏度时所面临的共同课题。

化学基质和生物学基质的干扰在LC-MS定量分析中可以体现为两个方面,即未知基质对被分析组分离子化效率的影响和在低分辨率仪器上相同质量数共存干扰离子的不可分辨。前者是主要的,经常碰到,后者则出现得较少。由于化学基质和内源性的生物学基质对于被测定化合物可能是数十倍甚至更高的量,其干扰的程度较严重,在低浓度组分的分析中常是导致定量误差的主要因素。化学基质和生物学基质对定量分析影响只能通过采用选择性更好的萃取方法和更好的柱上分离来缩小,达到尽可能好的程度。

来源于不同人或动物的样品(血样、尿样),其基质的种类和量都会不同。来源于同一个人或动物的,但处于不同时间段的样品,其基质的种类和量也会有或多或少的变化,要根据定量测定的不同目的和具体要求对具体样品的生物学基质的影响作出评价。如果是单纯的含量测定,基质的影响主要体现在批间差、日间差上。如果是与其他研究相关的定量,如历时较长的药代动力学实验中所涉及的定量测定,则会对实验的整体结论产生重要的影响。此时要对基质和离子化效率的关系作出全面的考察和评价,对它的影响做到心中有数,以便得到准确、可靠的实验结果。

在采用内标方法测定时要注意基质对被测定组分和内标物的离子化影响的区别,尤其是内标物和被测定物的化学性质有一定差别时,基质的影响往往是不同的。

化学基质的影响主要体现在缓冲液的种类、浓度以及溶剂的纯度上。此时要特别注意难挥发盐(如磷酸盐)的累积效应(指难挥发盐在喷口和其他附件上的沉积)。具体操作中要注意离子化区的电流变化,一旦发现较大的电流波动要及时调整或更换缓冲液。

就仪器配置而言,APCI-MS-MS适用于小分子化合物的分析检测。具体原因一如下:①加热喷雾方式的接口决定了该配置适用于种类广泛的大流量溶剂,减小了其他中性杂质组分的干扰;②MS-MS配置有较高的选择性,可以有效地抑制基质的影响。

样品的预处理

LC-MS的失败常常是由于样品的预处理不当,导致样品信号抑制或共存物的干扰。尤其是用ESI-MS直接进样时,应除去样品中浓度较高的盐及其他干扰成分,以避免污染离子源,降低分析背景,从而保证分析结果的准确性。根据ESI机理,ESI电荷分布在液滴表面,当样品中混有其他杂质时,很容易与样品分子在液滴表面形成竞争;同时样品中混有的磷酸盐等难以挥发的物质也会减缓带电液滴挥发,阻碍离子化的样品转化为气态,从而严重妨碍离子化进程。对于复杂化合物,如天然产物(中药、动物、植物等)的粗提物、生物体液(如血浆等)“脏”的样品,更应注重样品的预处理。样品预处理的具体方法、步骤视样品的性质而异。常用的一些方法有以下几种。

(1)超滤

采用超滤膜过滤器,截留相对分子质量从3×10-3至1000×10-3的均有商品供应。

超滤器根据相对分子质量大小选择性保留或通过溶液中的成分。低相对分子质量化合物存在于滤液中,而高相对分子质量化合物留在滤器上。

这种方法简便、快捷,易于实现自动化。经超滤制备出来的样品通常即可进行LC-MS分析。

在药物动力学或代谢物研究中,如超滤制备样品,可选择滤器,其截留相对分子质量为1000~3000,以降低相对分子质量的药物或代谢物从血浆中分离出来。通常将1~5mL样品用等体积的50%乙腈水溶液稀释以减少样品与底物的结合,混匀后,将混合物移至超滤管,离心15~30min(4000g),取滤液直接进行LC-MS分析或冻干后,用HPLC流动相溶解进行测定。

(2)溶剂提取

待测成分自水相提取至有机相是常用的方法之一。这个方法的优点是应用范围广;溶剂、pH、离子对试剂等均可选择,以利提取;可浓集待测成分。缺点是耗时;有时回收率较低。

(3)固相萃取

固相萃取(SPE)利用小柱(C18)选择性保留待测成分而使干扰物流出;或使待测成分流出而干扰物被小柱保留,从而达到纯化样品的目的。用SPE技术可除去杂质和盐,浓集待测成分,有机相或水相变换,小柱上衍生化等,因而其应用越来越广泛。

可供选用的小柱,非极性固定相有C18、C8、C4、苯基化合物等;极性固定相有氰基化合物、硅胶、氨基丙基化合物等,此外还可以选用离子交换剂作固定相。

以常用的C18小柱为例,SPE的操作步骤通常为:①用乙腈甲醇洗涤小柱;②用缓冲溶液(pH应调节至能使待测成分呈中性而使干扰成分为离子)5~10mL处理小柱;③将样品慢慢加在小柱上;④用上述缓冲溶液洗涤小柱,约需溶液5~10mL以除去干扰物;⑤用80%乙腈甲醇的水溶液5~10 mL洗脱待测成分;⑥浓缩(冻干、蒸发),溶于少量适当溶剂后即可进行分析。

(4)柱切换(LC/LC)

将样品注入预柱,使待测成分与干扰物分离;由切换阀将待测成分转入分析柱,进行分离分析。

用柱切换技术可在线纯化和浓集样品,便于自动化,减少样品损失,缩短分析时间,结果再现性较好。缺点是需复杂的色谱系统。

柱切换的方式有以下几种:①中心切割(取中间一定保留时间的成分转移至分析柱);②反冲(待测组分在预柱柱头浓集,反冲至分析柱);③前沿切割(较早流出的成分转移至分析柱);④末端切割(最后流出的成分输入分析柱)。

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