一、概述

某些物质受光照射后发射出较激发光波长为长的光称为荧光。由于物质分子结构不同，所吸收光的波长和发射的荧光波长亦有些不同。利用荧光的物理特性进行定性与定量测定，此即荧光光谱法(fluoimetry)。

荧光光谱法又称荧光分光光度法，测定灵敏度比一般分光光度法高，可达到10-10g/ml，而紫外分光光度法为10-7g／ml。通过测定荧光强度，可对许多痕量有机和无机组分进行定量分析，尤其对生物体系来说，存在许多有用的荧光光谱法应用实例，如药物及其体内代谢产物的研究等。

二、基本原理

某些物质吸收一定的紫外光或可见光波长的光能后，先在分子内部进行转移，消耗了部分能量再发射出来，亦就是其原子中某些电子从基态中的最低振动能级被激发跃迁到较高电子能级几个振动能级上，激发态通常经过非幅射“振动弛豫”迅速衰变。由于电子在同类分子或其他分子中撞击，消耗了相当能量。当两电子能层非常接近，以致于较低的电子能级振动能够被激发时，就会发生内转换。被激发到较高量子能级中较高振动能级的分子，下降到第一电子激发态中的最低振动能级，能量的这种转移形式称为无辐射跃迁。电子由第一激发态中的最低振动能级下降到基态中的任一振动能级时，同时发射出比原来所吸收的频率较低，波长较长的一种荧光能，这种光能就是荧光((nuorescence)。

被这些物质所吸收的紫外光或可见光称为激发光，产生的荧光称为发射光。荧光光谱法不是测定激发光的强弱，而是测定发射光的强弱。物质的激发光谱和荧光发射光谱，可以作该物质的定性分析。

由于物质在受到激发光之后发出波长较长的荧光，因而溶液的荧光强度和该溶液的吸光程度以及溶液中荧光物质的荧光效率有关，存在着下列关系：

F=ψJ0ECL （19-1）

式中：F表示荧光强度；E表示吸收系数；p表示荧光效率；c表示荧光物质的浓度；^表示入射光每秒每平方厘米的强度；L表示液层的厚度。式(19—1)是幂级数展开后的第一项，在溶液浓度很稀且不超过2％的入射光被吸收时成立。对于某一荧光物质，在一定频率和一定强度的入射光的照射下，如吸收的百分率不太大，且溶液的浓度很小，溶液的厚度、所用溶剂及温度等条件不变时，在一定的浓度范围，物质的发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，应用此种关系，可用作定量分析。

正是由于荧光测定都是在很稀的溶液中进行，所以也使得荧光法特别适用于测定微量或痕量组分。

三、荧光分光光度计

1．仪器构造

测量荧光的仪器类似于紫外一可见分光光度计。当光源(氙弧灯)通过狭缝，经激发单色器色散、经狭缝和分束器入射到被测物质样品室(或供试品池)，通常观察的是与激发辐射成90。角处供试品发射的荧光，荧光经分束器，导人发射单色器色散后，进入光电倍增管的检测器检测，信号经放大器放大后，由计算机处理记录或附有数据处理器处理。

常见荧光分光光度计型号有PerkinElmerLS30、LS45、L550、LS50B和LS55；岛津RF一501、RF一502、RF一540、RF一5000；日立F4000、F4500等。

2．仪器校正

(1)激发光谱和荧光光谱的校正由于仪器光源的强度随波长而改变，同时每一个检测器(如光电倍增管等)对不同波长的接受敏感度(强度)不同，即检测器的感应或波长不成线性，在使用单光束荧光分光光度计时，需进行校正，以消除误差。在用双光束荧光分光光度计的影响不大。

(2)波长的校正用汞弧灯的标准谱线对单色器的波长进行校正或用仪器所附的校正设备，应符合仪器说明书的规定。

(3)灵敏度的校正以仪器被测出的最低信号来表示，或以某一标准荧光物质的稀溶液在一定激发波长照射下，能发出最低信号荧光的最低浓度表示。应符合仪器说明书的规定。

由于影响荧光测定因素较多，因而荧光光谱法均是在一定条件下，选用一种稳定的荧光物质配成一定浓度的标准溶液进行校正，使每次所测得的荧光强度调节到相同数值(50％或100％，)，从紫外区到可见区内常用的标准荧光物质有酚(溶于甲醇)，吲哚(溶于乙醇)、奎宁[溶于硫酸液(O．1moL／L)]、罗丹明B(溶于水)及荧光素钠(溶于水或醇)等，最常用的为硫酸奎宁，它产生的荧光十分稳定。取O．001g奎宁标准品，溶于1L硫酸(0．1mol/L)，使成浓度为lμg/ml的溶液，取此溶液稀释成不同浓度，用于仪器校正。

3．测定方法

在药品检验中，按药品标准各品种项下的规定，制备供试品溶液及对照溶液。选定激发光波长及发射光波长，并在测定前，用一定浓度的对照溶液校正仪器的灵敏度后，在相同的条件下，读取对照溶液及其试剂空白与供试品及其试剂空白的读数。

4．测定注意事项

(1)荧光分析由于灵敏度高，溶剂不纯会带入较大荧光，应先作空白检查，必要时经纯化后再用。

(2)对易被光分解的化合物，可选择激发光波长和发射光波长与之近似而对光稳定的物质溶液，例如蓝色荧光可用硫酸奎宁的硫酸溶液，黄绿色荧光可用荧光素钠水溶液，红色荧光可用罗丹明B水溶液等，先与对照溶液比较测定其读数关系，并在测定供试品溶液时用以代替对照溶液以校正的灵敏度。

(3)溶液中的悬浮物对光有散射作用，如果荧光光谱与此种散射光重叠或部分重叠，影响荧光的溅量。应在测定前设法将散射光除去，如可用垂熔玻璃漏斗滤过或离心法除去悬浮物。

(4)温度对荧光强度有较大的影响，故测定时应控制温度一致。

(5)溶液中溶解氧有降低荧光作用，以致荧光与荧光物质的浓度不呈线性关系，此现象称为荧光的熄灭，必要时在测定前通人惰性气体除去氧。

(6)当荧光物质本身为弱酸或弱碱时，溶液pH值的改变对荧光强度有很大的影响，测定时应控制pH值一致。

(7)测定用的玻璃仪器与供试品池等必需保持高度洁净。

四、应用

荧光分析在那些浓度太低而难于以分光光度法、比色法或发射光谱法定量的浓度测定中极为有用，测定浓度常为O．01¨g／ml。荧光的灵敏度高，选择性好，需样量少、操作快速，已成为药学、医药、生物学、农业以及药物在体内代谢和环境卫生检测等的分析手段。

荧光光谱法在有机药物分析上得到较多应用，但有机脂肪族化合物的分子结构较为简单，很少会产生荧光；而芳香族化合物由于具有共轭的不饱和体系，易吸收光能，结构庞大而复杂的化合物，在紫外光或可见光照射下大多能发生荧光。药物中胺类，蛋白质、酶、维生素、抗生素、甾类等多具有荧光性质，中草药中有较多具有芳香性结构的大分子杂环类，能产生荧光，均可采用荧光法进行鉴别及含量测定。无机化合物很少能发生荧光；它们主要依靠待测元素与有机试剂÷i合组成具有荧光特性的配合物，目前采用有机试剂以进行荧光分析的元素已有几十种之多。

在应用中，由于不易测定绝对荧光强度，故荧光光谱法都是在一定条件下，用对照溶液试验浓度线性范围后，再在每次测定前，用一定浓度的对照溶液校定仪器的灵敏度；然后在相同条件下，读取对照溶液及其试剂空白与供试品溶液及其试剂空白的读数。

因荧光光谱法中的浓度与读数的线性较窄，故Ra一Rsb与Rr一Rrb相比较，应为O．50～2．O；如有超过，应在调节溶液浓度后再测定。

以利血平片含量测定的荧光光谱法为例：

【含量测定】避光操作。取本品20片，如为糖衣片应除去包衣，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于利血平O5mg)，置lOOml棕色量瓶中，加热水lOml，摇匀后，加三氯甲烷lOml振摇，用乙醇定量稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液，用乙醇定量稀释成每1ml约含利血平21μg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取利血平对照品lOmg，置lOOml棕色量瓶中，加三氯甲烷lOml溶解后，再用乙醇稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml，置lOOml棕色量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液与供试品溶液各5ml，分别置具塞试管中，加五氧化二钒试液2．Oml，激烈振摇后，在30屯放置l小时，照荧光分析法，在激发光波长400nm处和发射光波长507rtm处测定荧光强度，计算。

讨论：①本品系芳香族不饱和化合物，在紫外线照射下能产生荧光，故可采用荧光光谱法测定。

②温度对荧光强度有较大影响，测定时应控制一致。

③浓度太大的溶液会有“熄灭效应”(quenchingeffects)作用及由于在液面附近溶液会对激发光吸收，使发射光强度下降，导致发射光强度与浓度不成正比，荧光光谱法应在低浓度溶液中进行，故本品浓度配制为21xg,／ml。

④由于荧光光谱法灵敏度高，干扰因素多，溶剂纯度要好，否则会带人较大荧光，并应先作空白检查；必要时用玻璃磨口蒸馏器蒸馏后应用。溶液中的悬浮物对光有散射作用，必要时应用玻璃垂熔漏斗滤去或离心法除去。所用的玻璃仪器也必须十分洁净。溶液中的溶解氧有降低荧光作用，必要时可在测定前通人惰性气体除氧。

⑤反应时间对荧光强度会产生一定的影响，有些药品随时间的延长荧光强度会增加或减弱，有些药物在一定的时间内荧光强度变化较大，而后荧光强度趋向平稳。

⑥计算时，先用前述的公式计算出浓度，再计算出标示量即可。

五、磷光和化学发光

和荧光一样，磷光也是光敛发光。在激发态和衰变的过程中，电子旋转的状态保持不变。在某些情况下，也会从单重态通过系间窜跃出现三重态。

系间窜跃后，处于T1状态的分子会通过振动弛豫，或在某些情况下“磷光”作用衰变，发射磷光是慢的辐射去活化过程(T1一S0+hv)，需要lO-4～lOs或更长的时间。通常只有通过冷却或固定化而减少外转换时才可以观察到磷光。磷光波长比荧光的波长更长。

在具有强荧光的化合物中观察不到磷光，对于被吸附在表面上的化合物，由于i重态的稳定作用，可以观察到室温磷光。

测定磷光的仪器同荧光计基本相同，不同的是需要附加一个机械切光器，把磷光与光源的散射光及衰变较快的荧光分离开来。磷光的测量一般在低温下进行。

当化学反应产生光时就发生了化学发光。在这种情况下，反应室是光源，简单的化学发光分光计由单色器和检测器组成。一个实际的重要化学发光体系是基于H2O3与鲁米诺的化学发光反应。

化学发光反应一般速率较慢，当某些金属离子存在时会催化这一反应，增强发光强度，利用这一现象可测定这些金属离子含量，还可以通过酶将分析物转化为化学发光物间接测定，如测定葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下生成葡萄糠酸和H203，利用H2O3与鲁米诺的化学发光反应就可以测定葡萄糖含量。

化学发光和荧光、磷光一样，都属于分子发射光谱法，义称为发光法．与吸收光谱法相比，发光法极为灵敏(10-9数量级)，在大部分情况下信号强度正比于样品的浓度，但是，在药物分析中，具有荧光、磷光或化学发光的样品数日是有限的。